基于LNA探针的两重实时荧光RT-PCR检测方法甄别新城疫中强毒株与弱毒株.pdfVIP

第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集 以使包装出来的慢病毒颗粒的稳定性更高，由其介导的RNAi 抑制作用持续时间更长，同时也使慢病 毒的感染细胞的范围进一步扩大。对于不同类型的细胞，其转染效率都较高，从而大大增加筛选可稳 定表达外源基因或shRNA 序列的细胞株的成功性。 本实验将包装后的表达shRNA 重组慢病毒假病毒颗粒侵染Vero 细胞后，倒置纤维镜观察，当G FP+细胞比例达到80%～90%时，将细胞进行传代，共传20 代，分别于第5 代、第10 代、第 15 代和 第20 代时，提取细胞基因组，通过PCR 及测序鉴定，结果显示每代细胞中均有shRNA 序列整合入 细胞基因组中，且序列碱基未发生突变，说明在细胞中通过慢病毒介导shRNA 可稳定的持续的表达。 利用脂质体等转染试剂介导的siRNA 直接转染，在细胞内siRNA 序列极易降解，使得其对靶基 因不能够实现稳定持久的干扰作用。与之相比，利用质粒载体或病毒载体介导 siRNA 序列在细胞内 或机体内表达，对靶基因能够起到较稳定持久的干扰作用。目前主要的病毒载体包括逆转录病毒载体 和慢病毒载体，其中慢病毒载体在侵染细胞后，利用自身的逆转录酶，以病毒的基因组RNA 为模板， 逆转录形成dsDNA ，然后在整合酶的作用下将其DNA 整合入宿主细胞基因组DNA 中，并随着细胞 基因组的复制而复制[3] 。而且与其他逆转率病毒载体相比，慢病毒载体对分化与未分化细胞的侵染能 力更强，转导效率更高，因此慢病毒载体目前广泛应用于介导RNAi 技术来进行基因功能、抗病毒等 方面的研究。根据本研究实验结果显示，可表达 shRNA 重组慢病毒假病毒颗粒，感染细胞后，将外 源基因整合入宿主细胞基因组中，且在细胞传代过程中，外源基因（shRNA 序列）没有发生碱基的缺 失，突变等现象。成功建立了稳定表达shRNA 序列的Vero 细胞系，将该细胞系接种鹅源新城疫病毒 后，经Real time RT-PCR 检测病毒NP 、M 基因mRNA 的表达情况，结果显示，对病毒基因表达均 具有较好的抑制效果，其中NP710-Vero 细胞系对病毒NP 基因mRNA 表达的抑制率为86.8% （P ＜0. 05 ），M646-Vero 细胞系对病毒M 基因mRNA 表达的抑制率为85.9% （P ＜0.05 ），与对照组具有显著 差异（P ＜0.05 ）；进一步应用TCID50 方法检测各细胞系对病毒细胞感染力的影响情况，结果显示，各 细胞系对病毒细胞感染力均具有一定得影响，其中NP710-Vero 细胞组病毒的TCID -4.21 50 为 10 /0.1 m L （P ＜0.05 ），M646-Vero 细胞组病毒的TCID -5.17 50 为10 /0.1 mL （P ＜0.05 ），与对照组的差异显著（P ＜0.05 ）。应用间接免疫细胞化学方法，检测病毒在各细胞系中的复制增殖情况，结果显示，NP710-V ero、M646-Vero 细胞系对病毒的复制增殖具产生了明显的抑制作用。本研究为在体内抗病毒的进一步 研究提供了一定的理论依据。 参考文献（略） 基于 LNA 探针的两重实时荧光 RT-PCR 检测方法甄别新城疫中 强毒株与弱毒株 1 1 1 1 1,2 1 1 1 1,2 1 1 孙洁 ，林庆燕 ，刘建利 ，吕建强 ，曹琛福 ，阮周曦 ，曾少灵 ，张彩虹 ，秦智锋 ，卢体康 ，花群义 （1．深圳出入境检验检疫局，广东深圳，518045 ；2 ．深圳市外来有害生物质检测技术研发重点实验室，广东深圳， 518045） 摘 要 新城疫强毒株是各国重点防控的重大动物疫病，对其的快速诊断和检测是防控新城疫暴发的前提和基础。为 了建立基于新型LNA 探针的实时荧光RT-PCR 检测方法鉴别诊断新城疫中强毒株和弱毒株，设计了两条针对新城疫F 基因裂解位点的新型LNA 探针，通过对 11 株新城疫病毒株进行检