粘膜佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63和CpG-ODN的鼻内免疫效果研究.pdfVIP

粘膜佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63及CpG×ODN 的鼻内免疫效果研究 王冠1段广．才2张庶民’马霄。王咏1亏叶两华’杨永弘1沈叙庄’ (首都医科大学附属北京儿童医院1郑州大学公共卫生学院2中国药品生物制品检定所3) 【摘要】目的研究大肠杆菌不耐热肠毒索无毒突变体mLT63和CpG．ODN鼻内免疫时的 佐剂效果。方法选用SPF级、雌性BALBtc鼠为实验动物，小牛血清白蛋白(BSA)、破伤 鼻内免疫小鼠，ELISA间接法检测免疫小鼠血靖和粘膜组织萃取液的特异性抗BSA、TT的 均可诱导其产生高水平特异性血清IgG抗体，与无佐剂对照组相比有显著性差异(p0．05)。 鼻内免疫BSA、IT联合mLT63佐剂组小鼠在肺粘膜组织中产生较高水平特异性IgG和IgA， 相比无统计学差异。鼻内免疫TT联舍mLT63组小鼠，在直肠和阴道粘膜组织中可测到高滴 IgG和IgA,抗体水平很低．与对照组相比没有明显差异。另外，其在小鼠阴道枯膜组织中诱 的佐剂效果同mLT63相似。当鼻内免疫BSA和TT，同时联用两个佐剂时所诱导血清及肺牯 膜组织IgG和Ig丸抗体水平与使用单一佐剂组相比无明显差异。在对不同剂量的mLT63对 时在诱导肺组织IgG抗体水平远高于同样佐剂与TT的实验组(p0．05)。鼻内免疫TT联合 膜组织的免疫反应，免疫原性强的抗原(TT)可在远端牯膜组织(直肠、阴道)诱导出更高 滴度的抗体；mLT63剂量的差异以及抗原对不同佐剂的反应则无显著不同。 【关键词1大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体(ru)；CpG·ODN；鼻内免疫 粘膜免疫是近年来国内外研究的热点．而粘膜佐荆在粘膜免疫中起着非常重要的作用。大 肠杆菌不耐热肠毒索(heat-labile 荆。研究表明LT佐齐j效果好但毒性较大，不能直接用于人体；LTB毒性虽低但佐剂性能亦随 之变差。因此，如何制备低毒、佐剂效果好的物质成为研究^员探索的目标“…。 近来，已经有国内外学者成功制各了LT的无毒突变体(mLT63，亦称LTK63)，其原理 是将IT的A亚基(LTA)中Al链的第63位的丝氨酸置换为赖氢酸，从而使ADP核糖基化 转移酶活性丧_踅。这种突变后的L．T毒性近乎为零，但佐剂性质仍然得以保留，并且已进行了 有关佐剂效果、不同剂量所能诱导抗体效果的实验睁“l，但其相关的报道仍较少，特别是国内 ．169． 尚未见有关其作为粘膜佐剂的研究报道。 CpG．ODN，即含有非甲基化的胞嘧啶鸟暖呤二核苷酸(CpG)的寡聚脱氧核苷酸(ODN) 也是近年新发现的粘膜佐剂，其本质就是一种短链的核苷酸序列，具有以非甲基化的cpG为核 心，5+端紧接2个嘌呤碱，3。端紧接2个嘧啶碱这样一个特殊结构。最早dqTokunaga等人发现， 后来有人将其用于DNA疫苗。近年来逐渐有国外学者将其应用为粘膜免疫的佐剂，动物实验 的结果表明，CpG．ODN是一种毒性很低、佐剂效果强大的物质，非常适合粘膜免疫‘”。”。 此外，佐剂的协同作用近年来受到重视。所谓协同作用是指在同一抗原的给予过程中同时 采用两种佐剂，这两种佐剂作用机理相近，使用后可获得更高的免疫应答水平或使原先不具有 佐剂效应物质或单独应用时效应很差的佐剂获得良好的效果。研究显示不同种类的佐剖同时使 用会产生协同作用，且可降低靶抗原的给予量，并可能获得更为适合的免疫应答结果。比如 再比如也有学者将壳聚糖与胞壁酰二肽作为佐剂联用亦获得良好效果。但也有报道指出： 变体联用时则不会出现协同效应。原因尚不清楚，推测可能与CT(或LT)A亚单位ADP核 糖基化转移酶活性是否存在有关。而国内目前尚未见有关的研究报道“””。 (GBS)荚膜多糖．重组霍乱毒素B亚单位(rCTB)的多糖．蛋白结合物的粘膜免疫研究，结 果显示CT可增加多糖，蛋白结合物的免疫原性”…。但由于CT本身也有很大的毒性，恐对今后 的粘膜佐剂效果的研究，以期能对下一步工作打下基础： 1材料和方法 1．1粘膜佐剂和免疫抗原： 1．1．1 mLT63基因的构建和表达：由郑州大学公共卫生学院段广才教授等合成，方法主要 为首先提取E．coli44815菌株的质粒，设计上游侧翼引物Pl (5’．AGTCGTCGACCGGATTGTc订℃订、GTAT．3’)和诱变引物P4 (5-ACGG