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腺病毒介导存活素RNA干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用_药学论文 腺病毒介导存活素RNA干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用_药学论文 作者：谢富华,王润秀,李莉萍，覃燕梅，梁念慈 【摘要】 目的： 研究腺病毒介导的RNA干涉（RNA interference, RNAi）沉默存活素（Survivin）表达后，对MCF细胞裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑制作用. 方法： 构建携带survivin shRNA表达质粒的腺病毒Ad，并检测其滴度；建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型；将重组腺病毒悬液行瘤周和瘤体注射，观察肿瘤生长情况；剥离瘤体称重并计算药物的抑瘤率；免疫组织化学检测Survivin蛋白表达情况. 结果： 成功建立人乳腺癌肿瘤模型，移植瘤成功率为90%（18/20）；给药后实验组移植瘤的生长速度慢于对照组；病理学检查为浸润性导管癌；剥离肿瘤组织称重发现实验组抑瘤率为28.89%（0.05）；免疫组化发现实验组Survivin蛋白表达区的吸光度值为（15.63±1.54），明显低于阴性对照组（30.45±6.72）和空白对照组（30.25±6.58），差异均有统计学意义（0.05）. 结论： 以腺病毒为载体，以survivin基因为靶点RNAi介导的基因治疗方法有望成为乳腺癌一种新的治疗策略. 【关键词】 RNA干扰; 存活素（survivin）; 重组腺病毒；裸鼠；基因治疗 0引言 存活素（Survivin）作为一种凋亡抑制蛋白，通过多条细胞信号传导通路抑制细胞凋亡，除了Wnt，FOXM1等通路可能参与乳腺癌Survivin蛋白的调控外［1-2］，尚有许多细胞因子如VEGF，p27，Stat等也与Survivin蛋白相关［3-5］. 目前，应用RNA干扰技术、核酶技术、反义核苷酸技术等进行的靶向survivin基因治疗研究，大多为体外实验，而在体内对肿瘤的生长抑制作用的研究还少见报道. 本研究在建立乳腺癌动物模型的基础上，以Survivin蛋白为靶点，通过RNAi技术和重组腺病毒技术，对乳腺癌的基因治疗进行体内研究，以期通过观察肿瘤生长抑制情况，探索肿瘤基因治疗的新途径，为实现抗乳腺癌生长与转移提供理论依据. 1材料和方法 1.1材料Blal/bnu/nu雌性裸小鼠20只，4～6 wk龄，体质量17～22 g（广东医学院实验动物中心；MCF7细胞（广东医学院分子生物学实验室保存）；HEK293细胞（中国科学院上海细胞研究所）；胎牛血清（杭州四季青公司）；RPMI 1640培养液（美国Gibeo公司）；腺病毒包装试剂盒（美国ambion公司）；小剂量腺病毒纯化试剂盒（广州展晨生物技术有限公司）；免疫组织化学检测试剂盒，Survivin mAb（北京中杉金桥生物技术有限公司）. 1.2方法 1.2.1重组腺病毒的构建与纯化将前期实验中构建的survivin shRNA表达质粒和阴性对照质粒，按pSilencer adeno 1.0CMV试剂盒与腺病毒纯化试剂盒说明书构建并纯化重组腺病毒,分别命名为Adsurvivin和Adcontrol. 1.2.2重组腺病毒滴度测定采用文献［6］的微量全细胞病变法检测病毒滴度. 取96孔板，每孔加入1×104 HEK293细胞，加培养液200 μL，置孵箱培养24 h. 待测病毒用DMEM全培养基稀释至10-2，10-3，10-4，10-5，10-6及10-7的稀释度病毒液体，吸去上清后，分别加入每个稀释度的病毒液体，每孔200 μL，每孔均设复孔，同时设培养基对照(不含腺病毒). 37℃，50 mL/L CO2条件下继续培养36～48 h. 镜下观察完全细胞病变现象，按以下公式计算滴度. 滴度（pfu/mL）=（接种细胞数×稀释度×10）/加入的病毒体积（mL）. 1.2.3人乳腺癌模型的建立按照文献［7］的方法，将MCF7细胞0.1 mL(1×1010～5×1010细胞/L)接种于裸鼠右前肢腋下，待瘤径达0.5 cm左右时随机分组，每组6只. 瘤内及瘤周同时注射0.1 mL Adsurvivin，Adcontrol或PBS［参照文献［8-9］的方法，病毒量为1×108 pfu/（只·次）］，1次/3 d，共9次. 用游标卡尺测量瘤体长径（a）和短径(b)，按公式计算移植瘤体积. 移植瘤体积（V，mm3）=πab2/6计算，观察3 wk，绘制生长曲线. 1.2.4标本采集及瘤组织病理学观察药物处理结束后3 d，脱颈椎处死裸鼠，剥出肿块称重，参照文献［10-11］的方法，按公式计算抑瘤率. 抑瘤率（%）=（1-实验组瘤重/对照组瘤重）×100%. 切取肿瘤、肺脏和肝脏组织制备组织切片，HE染色后采用光镜观察并分析. 1.2.5免役组织化学检测按SP法要求，对肿瘤组