苯丁酸钠体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响_医学论文.docVIP

苯丁酸钠体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响_医学论文 苯丁酸钠体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响_医学论文 作者：孟玫，王春亭，蒋进皎，张继承，姜军梅 【摘要】 ［目的］ 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（PB）体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响。［方法］不同浓度苯丁酸钠处理HepG2，应用MTT比色法观察苯丁酸钠对HepG2的生长抑制作用，落射荧光显微镜、DNA电泳和流式细胞仪观察HepG2的凋亡，Western blot检测苯丁酸钠处理前后HepG2细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达水平的变化。［结果］ 苯丁酸钠2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L作用48h对细胞的抑制率分别为19.41%、39.03%、42.19%，作用72h对细胞的抑制率分别为27.42%、57.11%、70.31%，并诱导细胞凋亡；4mmol/L苯丁酸钠作用HepG2 48h细胞凋亡率明显高于对照组。落射荧光显微镜和DNA电泳均观察到苯丁酸钠作用后HepG2细胞出现凋亡细胞的特征性变化。苯丁酸钠处理HepG2后Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加。［结论］ 苯丁酸钠体外抑制HepG2增殖并促进其凋亡，其作用机制可能是通过降低细胞内的Bcl-2蛋白，增加细胞内Bax蛋白而实现的。 【关键词】 肝肿瘤 近年来越来越多的研究资料表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（PB）对白血病、淋巴瘤以及多种实体瘤具有诱导分化和治疗作用[1~4]，同时作为一种诱导分化恶性肿瘤的新药，苯丁酸钠具有广谱、高效、低毒的特性[5]。我们在实验中观察了苯丁酸钠对人肝癌细胞HepG2的作用，探讨苯丁酸钠对HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。 1 材料与方法 1．1 细胞培养 HepG2细胞购自山东省医学科学院细胞室。培养基为含10％胎牛血清的RPMI1640（Gibco公司产品），置于37°C 5%CO2的孵箱内培养。48h传代，0.25%的胰酶、 0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二钠）消化。取对数生长期的细胞进行实验。 1．2 药 物 苯丁酸钠购自ALEXIS，用RPMI1640培养基溶解为20mmol/L浓度备用。 1．3 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验 将HepG2细胞悬液浓度调整为5×104/ml，每孔200μl接种于96孔板，实验组分别加入不同浓度的苯丁酸钠，对照组不加药，另设空白对照孔（只加培养基，无细胞），每组设三个平行重复孔。继续培养，分别在48h、72h各取三孔加入MTT（5mg/ml）20μl，放置孵箱内4h后弃上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸钠）200μl，过夜。震荡15min，用全自动酶标仪（Denley Drangon Wellscan MK2）检测570nm处的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A对照-A实验）/（A对照-A空白）×100%。 1．4 荧光染色观察细胞凋亡 常规收集对照组、苯丁酸钠处理组细胞，4℃ PBS洗涤2次。加入荧光染料Hoechst33342（Anaspec产品）至终浓度为2.5μg/ml，37℃避光孵育染色30min，取细胞悬液滴于清洁的载玻片，盖上盖玻片，落射荧光显微镜（JEOL-1200EX型）下观察细胞。 1．5 流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡 对数生长期的细胞用无血清的RPMI1640培养24h同步化后，分组干预48h。收集不同处理组细胞，4℃ PBS洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×106个/ml，取100μl细胞悬液与含1%RNA酶的Tis-HCl缓冲液混匀共同孵育10min，加入碘化丙啶（PI）和异硫氰酸荧光素（flucresceinisothiocyanate，FITC）标记的磷脂酰结合蛋白（AnnexinV）各5μl混匀，避光37℃孵育30min，FCM（FACScan美国BD公司产品）检测，凋亡细胞AnnexinV-FITC（+）PI（-），正常活细胞AnnexinV-FITC（-）PI（-），坏死细胞AnnexinV-FITC（+）PI（+），利用Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。 1．6 DNA电泳 收集对照组，苯丁酸钠处理组细胞各5×107，4℃PBS洗涤2次，采用常规的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法。提取出的DNA用2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色AlphalmagerTM 2200数字电泳凝胶成像系统成像分析。 1．7 Western印记法检测Bcl-2、Bax表达蛋白 收集约5×107的细胞，PBS洗涤2次，细胞裂解液（50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，1g/L SDS，1mM DTT，10ml/L Np-40，10g/L脱氧胆酸钠，25mg/L亮抑素，25mg/