血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究_医学论文.docVIP

血管内皮生长因子受体对宫颈癌细胞凋亡的效应研究_医学论文 血管内皮生长因子受体对宫颈癌细胞凋亡的效应研究_医学论文 作者：刘琰，杨婉华，马湘一，陈睿，汪蕊，卢运萍，马丁，王世宣 【摘要】 　　目的 研究血管内皮生长因子受体（VEGFR）在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法 用基因重组方法构建人反义VEGFR基因真核表达载体，用电穿孔法转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。采用Western Blot分析转染前后细胞中VEGFR蛋白的变化。利用Hoechst33258染色和流式细胞仪观察转染后Hela细胞的凋亡情况。结果 转染反义VEGFR质粒后, Hela细胞VEGFR的蛋白表达水平明显下降，细胞凋亡率明显增加(0.01)。结论 抑制VEGFR的表达可促进宫颈癌细胞的凋亡，VEGFR可能是肿瘤基因治疗的一个潜在新靶点。 【关键词】 VEGFR　反义核酸　凋亡；宫颈癌 　The Effect of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Key words：VEGFR；Antisense nucleic acid；Apoptosis；Cervical cancer 　血管内皮生长因子受体属于酪氨酸激酶受体家族, 在胚胎发生的初始阶段存在于所有的内皮细胞，随后定位于小静脉和淋巴管，是成熟淋巴管内皮细胞的特异性标志物[1]。VEGFR主要通过与其配体VEGF、VEGF结合后，促进淋巴内皮细胞的增殖、分化，诱导淋巴管生成，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[2]。在肿瘤组织中可见肿瘤周边的新生淋巴管、扩张的淋巴管、有癌栓的淋巴管内皮细胞VEGFR呈高表达[3]。 现有研究表明VEGFR在多数肿瘤细胞上也有相应表达[4]，但关于其在肿瘤细胞中的效应及作用机制尚不清楚。我们自行设计了VEGFR的反义重组质粒，通过电穿孔转染法瞬时转染人宫颈癌细胞株Hela细胞，观察反义封闭VEGFR后Hela细胞凋亡情况的变化，对VEGFR在宫颈癌细胞中的作用及其机制进行初步探讨。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 主要试剂与仪器 培养基DMEM、Trizol购自美国Gibco BRL公司；胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；M逆转录酶、pGEM载体购自美国Promega公司；PCR引物购自上海博亚生物技术有限公司；兔抗人VEGFR多克隆抗体、兔抗人β多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG均购自美国Santa Cruz公司；ECL显色试剂盒购自美国Pierce公司。 1.1.2 细胞培养 人宫颈癌细胞株Hela购自美国典型物种保藏中心（ATCC）, 培养在含10％胎牛血清的DMEM中，置饱和湿度5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。 1.2 VEGFR反义核酸载体的构建 1.2.1 VEGFR目的基因的制备 根据NCBI Genebank 登录的VEGFR的cDNA序列, 利用Primer5.0设计VEGFR胞外1～3区的引物，上游引物设计BamHⅠ酶切位点，下游引物设计EcoRⅠ酶切位点，上游引物序列为：5’下游引物序列为：5’。按Trizol说明书从胎盘组织中提取总mRNA(由华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科提供)，再以RT方法大量扩增VEGFR目的片断。PCR循环条件：94℃预变性5 min、94℃变性30 s、56℃复性30 s、72℃延伸45 s，共35个循环，全部循环结束后，于72℃做10 min终止前延伸。1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物纯化试剂盒纯化目的片断。 1.2.2 反义VEGFR重组质粒的构建 按常规分子生物学方法，将目的基因和载体连接。连接产物转化，挑取阳性克隆, 小量摇菌后酶切初步鉴定、测序。 1.3 基因转染及细胞分组 参考《分子克隆》采用电穿孔转染法，将电击完的细胞转移至已加入适量培养基的35mm培养皿中，培养皿置于含5％CO2的37℃孵箱, 24h后观察转染效率。 细胞分组：空白组（不做处理的Hela细胞），对照组（转染空质粒pGFPC1的Hela细胞），实验组（转染反义质粒的Hela细胞）。 1.4 WesternBlot分析转染前后细胞VEGFR3蛋白的表达 分别提取空白组细胞、转染空载体及转染反义质粒48h的Hela细胞总蛋白，参考《分子克隆》实验方法，按ECL显色试剂盒说明书曝光成像。 1.5 转染细胞生物学效应的观察 1.5.1 Hoechst33258观察转染前后细胞形态学的变化 将空白组、对照组和实验组的Hela细胞分别置于预先放入玻片的六孔板中，待24 h后取出玻片，PBS漂洗，固定，待干燥后由Hoechst33258室温避光染色30min，封片后荧光显微镜观察。 1.5.2 流式细胞法检测Hela细胞凋亡率 分别收