绿色荧光蛋白的研究进展.pdfVIP

中国畜牧兽医 2008年第35卷第8期 生理生化 ·29· 绿色荧光蛋白的研究进展 杨慧敏1。李文刚2，吴高锋1．魏娟1。王鑫1 (1．河南农业大学，郑州450002；2．郑州牧专，郑州45001I) 摘要：绿色荧光蛋白(GFP)作为一种新型、方便的报告基因，具有很多理想特性，它灵敏度高，能在细胞内稳定表达，不 需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等，已成为目前最优良的标记基因之一。其显著特点 是在不加外源物质的情况下，受紫外光激发，就能在原核和真核活细胞中发出绿色荧光，而且荧光性质稳定，对细胞无毒，其 特有的生化性质使其在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。 关键词：绿色荧光蛋白；荧光强度；转基因 中图分类号：Q516 文献标识码：A 文章编号：1671—7236(2008)08一0029一03 fluorescent 除去某些变性剂，荧光就可恢复并具有和原来一致 绿色荧光蛋白(green protein， GFP)是20世纪90年代中期发展起来的一种全新 的报告分子。同以往常用的报告基因LacZ、CAT、的吸收、发射光谱基本相同。 荧光素酶基因以及其他抗生素基因相比，GFP不需 1．2相对分子质量小，对细胞无毒性GFP是一 要任何外源性底物和辅助因子，无毒、稳定、无污 种良好的标记物，分子量较小是它作为报告基因的 染，而且可以在UV或蓝光激发下直接观察。因 一大优点，GFP与目的基因融合后，对目的基因的 此，其被广泛应用于分子生物学研究。Rasher等结构功能没有影响，大量表达对细胞也无毒性作用， (1992)首次克隆得到多管水母的GFP基因。GFP细胞仍可连续传代培养。 基因由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨1．3检测方便，可直接用于活体测定 因为GFP 基酸。Chalfie等(1994)首先在大肠杆菌细胞中表荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在 达了GFP，开创了GFP应用研究的先河，之后很快 这些物质可能难于进入细胞的问题，只需紫外光或 发现GFP能在多种异源细胞内表达，因此在多个学 蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉 科领域引起了广泛的关注，被誉为“活细胞探针”。 眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表 野生型GFP荧光强度较低，受温度影响大，其应用 达也可识别。且可进行活体观察，不会损伤正在生 受到了限制。Heim等(1995)采用定点突变的方式，长的细胞和组织。 把第65位丝氨酸换成苏氨酸或胱氨酸，荧光强度提 1．4无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限 高了4--．6倍。后来的研究中用到的GFP突变体都 制GFP基因的共用性首先表现在它的表达几乎 是在此基础上通过改变若干碱基而得到的。增强型 没有受体范围的限制，在原核和真核生物中都获得 fluorescent 绿色荧光蛋白(enhancedgreen protein，了成功的表达，这是一种在生物界较为“通用”的 EGFP)是其中具有代表性的一种，其荧光强度显 基因。 著提高，而且更适合于在哺乳动物细胞表达。 1．5不受假阳性干扰，灵敏度高 由于其他生物本 1 GFP作为标记基因的优点 身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果。GFP作 1．1不需加任何底物，荧光性质稳定GFP作为 为分子探针可以代替荧光染料，避免由于染料扩散 报告基因不需加任何底物且荧光非常稳定。只有在 造成的定位不准，使结果真实可靠。而且其灵敏度 过热、过酸、过碱或添加某些变性剂的条件下，GFP 高，比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分 才会变性，甚至荧光消失。一旦恢复中性环境，或 辨率。