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银染mRNA差异显示法克隆肝癌相关基因_医学论文 银染mRNA差异显示法克隆肝癌相关基因_医学论文 作者：王新，黄裕新，闻勤生，王庆莉 【关键词】 肿瘤mRNA差异显示法 　　关键词: 肿瘤mRNA差异显示法银染基因克隆 中图号:R735.7 文献标识码:A 　　摘 要:目的 建立银染mRNA差异显示方法，筛选并克隆肝癌相关基因. 方法 以建系的人肝癌细胞HepG2和正常的肝细胞L02的总RNA为模板，用5’-dT11 G锚定引物和8条随机引物（AP1～AP8）组合进行RT-PCR扩增，PCR产物经60g#12539L-1 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，凝胶银盐染色显示差异的DNA片段. 结果 建立了快速敏感的银染mRNA差异显示方法，分离并克隆了一些肝癌相关基因. 结论 建立的银染mRNA差异显示法简单、有效，在差异表达基因的筛选中有较高的实用价值. 　　Keywords:tumormRNA differential displaysilver stain-ingcloning of gene 　　Abstract:AIM To develop mRNA differential display poly-merize chain reaction（DD-PCR）method with silver staining and to clone the liver cancer related genes in HepG2cell line.METHODS Total RNA was extracted from the HepG2cells and L02cells.Their first strains of cDNA were produced by reverse transcription（RT）.The cDNA were amplified by PCR using an anchored primer5’dT11G combined with eight arbitrary primers respectively.The products of PCR were an-alyzed on a denaturing60g#12539L-1 polyacrylamide gel.The differential DNA bands on gel were seen by silver-staining. 　　RESULTS Several liver cancer related genes were isolated and identified by the sensitive silver-staining mRNA differen-tial display developed.CONCLUSION The established mR-NA differential display method with silver staining is a sim-ple，efficient means which has higher value for screening and cloning differentially expressed genes. 　　0 引言 　　 mRNA差异显示（mRNA differential display PCR，DD-PCR）方法是分离差异表达基因的有效方法［1，2］ .自从DD-PCR发明以来，已被广泛用于多种差异基因的筛选和克隆，即使DD-PCR方法有一定的局限性［3，4］ ，但近年来仍有许多成功的范例［5-9］ .虽然新的差异筛选方法如代表性cDNA差异显示，消减杂交和抑制性消减杂交等应运而生并异军突起，但因DD-PCR相对简单、直观、有效而仍受众多研究者的青睐［10-13］ .常规mRNA差异显示法是通过放射性同位素进行放射自显影来比较表达基因的差异，因而给本方法的普及和操作带来了一定的困难，荧光染料法虽避免了同位素放射自显影带来的不便，但其价格较贵，且灵敏度与银染法相近.因而建立一套快速、简便、价廉、易掌握和推广的银染mRNA差异显示实用技术，在众多差异基因的初步筛选中具有很高的应用价值.我们结合自己的工作，以此方法从肝癌细胞中初步分离并鉴定了一些肝癌相关基因. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　人肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02购自中科院上海细胞生物研究所.菌株DH5α由本室保存.pUC-Tm载体购自上海生物工程公司.总RNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒为上海生工产品.反转录酶M-MulV，Taq-PlusⅠ聚合酶为MBI产品，锚定引物和随机引物由生工合成.放射性同位素