PCR及SSCP.pptVIP

吴耀生 生物化学与分子生物学教研室 2013.03.16 PCR研究程序 1.研究目的片段的确定(研究目的) 2.引物的设计及合成(决定扩增的特异性) 3.PCR反应的制备( 微量操作) 4.PCR扩增(在PCR仪中进行) 5.PCR产物的检测(琼脂糖凝胶电泳) 6.结果的分析与判断(紫外灯下观察) 单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymor-phism，SSCP) 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。因此称该方法为单链构象多态性分析法。 SSCP-PCR研究程序 1.研究目的片段的确定(研究目的) 2.引物的设计及合成(决定扩增的特异性) 3.PCR反应的制备( 微量操作) 4.PCR扩增(在PCR仪中进行) 5.PCR产物变性处理(碱变性或化学试剂) 6. 电泳检测(PAGE) 7. 银染（显示不同构象带） 8. 分析结果(判断有无突变) 3. SSCP还用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上 4.另外，Yap等还将SSCP用于DNA定量分析上 SSCP-PCR基本操作步骤 其基本过程是: 1.PCR扩增靶DNA; 2.将特异的PCR扩增产物变性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子; 3.将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; 4.最后通过银染显色分析结果。 OB基因 人的OB基因定位于第7号染色体长臂（7q31.3），在人类基因组中为单拷贝，全长约20kb，含有3个外显子，外显子全长4240bp 。OB基因只在脂肪组织中表达，其编码产物瘦蛋白是一种分泌性蛋白，即瘦素（Leptin），或瘦蛋白，是由167个氨基酸残基组成的。瘦素在脂肪组织合成后，分泌到血液中，在血液中与其受体LEPR结合。 Ob基因的PCR 3.聚丙烯酰胺的配置 ⑵ 倒胶 将胶灌于两槽之间，立即插入梳子（勿使梳齿下有气泡），室温下凝胶后，垂直拔出梳子。用电泳缓冲液冲洗加样孔。 4.PCR产物的处理及上样 PCR产物 10μl 0.5mol/L NaOH 1 μl 5mmol/L EDTA 1 μl 5.电泳 1×TAE为电泳缓冲液 ? 160V，电泳2h Ob基因点突变分析 Ob基因点突变分析 异常样品：在SSCP中显示异常的4例样品中，3例的测序结果与对照样品一致，仅1例显示第25位密码子发生点突变，由CAA（谷氨酰胺）→CAT（组氨酸），该对象为壮族男性NIDDM伴ob患者。 Ob基因点突变分析 1994年，Zhang YY克隆并测序了小鼠的ob及其人类的同源序列，它们均编码一种具有167个氨基酸的分泌性蛋白，在人和小鼠之间氨基酸序列有84%的同源性。巳证实，当小鼠ob基因突变时，可导致小鼠肥胖及NIDDM表型（3）。研究表明，ob基因产物可能在脂肪组织信号通路中起作用，调节体脂的贮存，ob基因仅在白色脂肪组织中表达，去除信号肽后成为145个氨基酸组成的leptin多肽，可分泌入血中，剌激脂类代谢而控制脂肪组织的重量。 Ob基因点突变分析 Karvonen（4）应用PCR技术筛查了200例芬兰肥胖病人ob基因的启动区和编码区，发现1例密码子48上G144→A置换，另1例密码子上110上G328→A置换; Considine(5)等检测了68例肥胖患者皮下脂肪组织ob基因编码区，仅发现1例G→A置换。 实验报告的书写格式 ⑤SSCP的结果断定: 检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无 变化。例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有 改变。另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果。另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定。 实验名称 一、实验原理 二、操作步骤 三、实验结果 四、讨论 两周后上交， 103馆二楼212办公室 生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学 * * SSCP-PCR法检测 检测人肥胖基因的点突变 聚合酶链式反应 PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是分子克隆技术中的常用技术之一。 基本原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNT