包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析_临床医学论文.docVIP

包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析_临床医学论文 包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析_临床医学论文 作者：施勇, 吴庆婷, 朱海艳, 李厚达 【摘要】 　　目的: 制备包裹pcDNA3.1重组质粒的免疫脂质体。方法: 采用逆相蒸发法, 制备含pcDNA3.1质粒的脂质体, 并与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体（mAb OX26）相连, 形成免疫脂质体, 并对其形态结构、 粒径、 包封率及偶联抗体的分布进行初步检测研究。结果: 所获得的免疫脂质体近球形、 平均粒径低于100 nm、 包封率达30.4%、 偶联抗体呈均匀分布。结论: 成功地制备了免疫脂质体, 为应用于体内试验奠定了基础。 【关键词】 NR2B 免疫脂质体 特征 　　脂质体是由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体, 可以延长包裹物的作用时间、 降低毒性, 具有一定的靶向性[1, 2]。免疫脂质体则是一种表面结合有抗体或抗体片段等物质的脂质体, 具有主动靶向的功能[3, 4], 为抗肿瘤和基因治疗提供了新的思路[5]。本研究中采用逆相蒸发法将真核表达质粒pcDNA3.1有效地包封在脂质体中, 形成纳米级颗粒, 并且与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体（mAb OX26）相连, 形成免疫脂质体, 并对其形态结构、 粒径、 包封率、 及偶联抗体的分布和数目进行了初步检测。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 pcDNA3.1重组质粒由本室保存; POPC(1、 Distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE)、 DSPE购自Avanti公司; DDAB(didodecyldimethylammonium bromide)购自Fluka公司; 薄膜挤出器购自Avestin公司; 旋转蒸发仪购自巩义予华公司; Sepharose CL为Pharmacia公司产品; 限制性内切酶购自Fermentas公司; 质粒小量提取试剂盒购自V公司; DNaseI和exonuclease III购自TaKaRa公司; 质粒大量提取试剂由孙怀昌教授馈赠; 其他试剂为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 重组质粒pcDNA3.1的扩增制备 用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA, 经BamH I酶切鉴定。将菌种大量培养, 大量提取质粒DNA。经10 g/L琼脂糖电泳检测其纯度, 并用紫外分光光度计测定其A260/A280值, 根据A260/A280比值估算其纯度, 根据公式DNA浓度=A260×50 mg/L×稀释倍数, 计算其质量浓度。 　　1.2.2 免疫脂质体的合成及抗体的偶联 采用逆相蒸发法将POPC、 DDAB、 DSPE及DSPE按一定比例溶解于氯仿中, 用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂, 置水浴超声波仪处理5 min, 加入一定量质粒DNA在42℃水浴和干冰中反复冻融, 并连续几次通过100 nm薄膜挤出器, 未包裹入脂质体的质粒用DNaseI和exonuclease III 37℃作用1 h, EDTA终止反应, 琼脂糖CL柱分离包裹质粒DNA的脂质体和被核酸酶降解的DNA, 琼脂糖凝胶电泳检测。mAb OX26经修饰巯基化后与包裹质粒DNA的脂质体室温下轻摇连接过夜, 再次用琼脂糖CL柱分离未连接的抗体和免疫脂质体。 　　1.2.3 脂质体的形态结构和粒径观察 取适量脂质体用3 g/L磷钨酸负染, 再滴至专用铜网上, 自然风干, 用透射电子显微镜观察脂质体的形态结构和大小。 　　1.2.4 免疫脂质体的特征分析 将收集到的未连接的抗体和免疫脂质体分别包被板子, 以HRP标记的羊抗小鼠IgG为一抗做直接ELISA实验, 以确定免疫脂质体是否已连接上抗体; 用5 g/L SDS破坏免疫脂质体的膜表面结构, 对其释放内部包裹的物质进行琼脂糖凝胶电泳观察; 同时将免疫脂质体与10 nm胶体金标记的抗小鼠IgG在0.018 mol/L Tris（pH＝8）, 3 g/L BSA, 170 mL/L甘油缓冲液中孵育1 h, 直接在透射电子显微镜下观察, 通过与mAb OX26特异性结合的抗小鼠IgG上胶体金的显色, 间接确定免疫脂质体上连接的抗体数目和分布。 　　2 结果 　　2.1 质粒DNA的提取 小量提取的pcDNA3.1质粒经酶切电泳鉴定其相对分子质量(Mr)约为9800 bp, 与预计相符。大量提取的质粒DNA经电泳和紫外分光光度计测定, 其质量浓度约1.2 g/L, A260/A280比值约为1.89, 表明提取的质粒DNA纯度较高。 　　2.2 透射电镜观察脂质体的形态结构及粒径分布 由透射电镜照片可见, 制备的脂质体为粒径均匀的球状或近球状的小囊泡; 粒径分布范围从30 nm至150 nm,