外源精氨酸对不同诱导型一氧化氮合酶表达程度的胃癌细胞生长的影响_临床医学论文.docVIP

外源精氨酸对不同诱导型一氧化氮合酶表达程度的胃癌细胞生长的影响_临床医学论文 外源精氨酸对不同诱导型一氧化氮合酶表达程度的胃癌细胞生长的影响_临床医学论文 【摘要】 目的 探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达与外源精氨酸补充对胃癌细胞生长的影响。 方法 RT法检测胃癌细胞株SGC及MGC中精氨酸酶Ⅰ、Ⅱ(AⅠ、AⅡ)及iNOS的mRNA表达，MTT法检测分别培养于富/无精氨酸培养基的SGC及MGC胃癌细胞株的生长情况，及加入1 μmol/L NOS抑制剂L单甲基精氨酸 (LMMA)后的生长变化。 结果 iNOS在胃癌细胞株MGC强表达，但在胃癌细胞株SGC表达极弱；2种细胞株AⅡ均强表达而AⅠ无表达。无论是否存在LMMA，富精氨酸培养条件下胃癌细胞株SGC的增殖均强于无精氨酸时 (0.05)，而在富/无精氨酸培养基中，是否加入LMMA均不影响胃癌细胞株SGC的增殖 (Pgt;0.05)。无LMMA时，胃癌细胞株MGC在富精氨酸培养条件下的增殖强于无精氨酸时 (0.05)；在无精氨酸培养基中加入LMMA不影响细胞生长(Pgt;0.05)；但在富精氨酸培养基加入LMMA可显著促进胃癌细胞株MGC生长(0.05)。 结论 外源精氨酸补充对iNOS高表达的胃癌细胞可能因iNOS产物的增加而产生细胞抑制作用，精氨酸耗竭策略可能更适合低表达iNOS的肿瘤细胞。 【关键词】 精氨酸； 一氧化氮合酶； 胃肿瘤； 肿瘤细胞，培养的 精氨酸是鸟氨酸循环中精氨酸酶完成氨解毒、合成多胺的唯一底物。精氨酸酶有2种亚型，Ⅰ型为肝精氨酸酶(hepatic arginase, AⅠ)，存在于肝细胞质；Ⅱ型为肝外精氨酸酶(extrahepatic arginase, AⅡ)，存在于线粒体基质。精氨酸同时也是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)合成NO的唯一底物[1]。在胃癌组织中，诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase, iNOS）的高表达已为人所熟知，而高精氨酸酶活性亦很常见[2。对不同乳腺癌细胞株的研究表明，精氨酸酶活性越高细胞增殖越快，而iNOS活性高时则相反，这主要是由于精氨酸酶高活性增加了细胞增殖所需的多胺合成，而iNOS活性高时增加的产物NO则明显抑制细胞生长[6]。为探讨这一现象是否同样存在于胃癌组织中，笔者检测不同iNOS表达程度的胃癌细胞株在富/无精氨酸培养基中的生长情况及与iNOS抑制剂L单甲基精氨酸(L的关系，探讨iNOS表达与外源精氨酸补充对胃癌细胞生长的影响。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 胃癌细胞株SGC及MGC为福建医科大学神经解剖研究室保存。细胞复苏后，以含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI培养基(美国Gibco公司)，37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒湿培养箱培养。 1.2 方法 1.2.1 条件培养基 无精氨酸培养基为不加入精氨酸的RPMI培养基，富精氨酸培养基为加入2 mmol/L精氨酸的RPMI培养基。 1.2.2 RT检测 不同细胞中，AI、AⅡ、iNOS以及β（内参照）的基因表达采用RT方法。以Trizol(美国Life Technologies公司)法抽提总RNA，Superscript Ⅱ试剂盒(美国Invitrogen公司)合成cDNA。按说明书操作。PCR引物序列如下： AI（278 bp） 上游：5’ 下游：5’ AⅡ（302 bp） 上游：5’ 下游：5’ iNOS（324 bp） 上游：5’ 下游：5’ 反应条件分别为：AI，94 ℃ 30 s→62 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，28个循环；AⅡ，94 ℃ 30 s→58 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，30个循环；iNOS，94 ℃ 30 s→60 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，28个循环。β为参照。RT分析重复3次，扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪记录灰度，以目标基因产物与β的灰度比值(x±s)为mRNA相对表达量，结果取平均值。 1.2.3 MTT法检测细胞生长情况 胃癌细胞株SGC及MGC于含10%FCS培养基的96孔板生长至50%～60%融合，分别加入最终浓度1 μmol/L的LMMA（美国Sigma公司）[7]。各设4组复孔。继续培养48 h，更换培养基，每孔分别加入0.5 g/L四甲基偶氮唑盐，37 ℃孵育6 h。弃培养基，加入DMSO甘油缓冲液，紫外分光光度计570 nm波长下记录吸光度。 1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计分析软件。用Kruskal检验，组间比较采用Mann检验。 2 结 果 2.1 AI、AⅡ