外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道局部甘露糖结合凝集素mRNA水平的测定_临床医学论文.docVIP

外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道局部甘露糖结合凝集素mRNA水平的测定_临床医学论文 外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道局部甘露糖结合凝集素mRNA水平的测定_临床医学论文 【摘要】 目的：初步探讨甘露糖结合凝集素（MBL）在外阴阴道念珠菌病（VVC）和复发性外阴阴道念珠菌病（RVVC）发病过程中的免疫机制。方法：选取2006年1月～2007年7月健康体检的女性、VVC患者、RVVC患者各20例，采集阴道灌洗液，半定量RT-PCR测定MBL-mRNA表达情况。结果：阴道局部MBL-mRNA的表达VVC患者显著高于正常人群，而RVVC患者显著低于正常人群。结论：VVC患者阴道局部MBL-mRNA高表达说明MBL参与了局部免疫反应，其在免疫防御中发挥了重要作用，而阴道局部MBL-mRNA的低表达可能和RVVC反复发作不易治疗有关，提示有必要对MBL水平低下者进行MBL临床治疗的研究。 【关键词】 外阴阴道念珠菌病； 甘露糖结合凝集素； 阴道灌洗液； mRNA 外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC）也称外阴阴道念珠菌病，是一种常见的阴道黏膜真菌感染性疾病， 75％的妇女一生中至少患1次VVC，临床上将每年发作VVC≥4次称为复发性外阴阴道念珠菌病（recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC）。对于VVC发病的免疫机制研究国内外报道甚少,且大部分研究只停留在动物实验阶段。本研究通过测定VVC患者阴道局部甘露糖结合凝集素（MBL）mRNA水平并与健康女性对照，探讨天然免疫在本病发病机制中的地位，以期为本病的免疫治疗提供理论依据。 1 对象与方法 1.1 研究对象 选取2006年1月～2007年7月在我院门诊健康体检女性，就诊的VVC、RVVC患者各20例，月经周期均规律，3组间各时相分布比较无显著差异。6个月内未服用甾体类激素，1周内无性生活及阴道冲洗。均排除妊娠、糖尿病和长期口服抗生素等易感因素。 正常对照组：妇科门诊进行健康体检的女性。妇科检查无异常，阴道分泌物检查无异常。 VVC组：检查见典型豆渣样分泌物，镜检见真菌菌丝及孢子，无其它病原菌混合感染，符合VVC诊断标准［1］。RVVC组：妇科门诊检查符合RVVC诊断标准［1］，即VVC经抗真菌治疗后症状、体征消失，真菌学检查阴性，再次发生VVC者称为复发。真菌培养为白色念珠菌，无混合感染。 1.2 标本的采集 研究对象取妇科检查体位，暴露阴道后擦去分泌物，用5 ml灭菌生理盐水冲洗宫颈及阴道上端，吸出灌洗液4～5 ml收集于专用试管，1 000 r·min-1离心10 min，细胞成分置于EP管中-20 ℃冻存待测。 1.3 半定量RT-PCR测定MBL-mRNA 1.3.1 MBL基因特异性引物的设计与合成 根据GenBank MBL基因cds序列，引物由上海生物工程有限公司设计，上游引物为5′-AGGCATCAACGGCTTC CC-3′,下游引物为5′-CCAGGCTACTATCACCATCC-3′;另外设计1对片段长度为270 bp的β-actin基因引物,上游引物为5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′,下游引物为5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′。 1.3.2 阴道灌洗液离心细胞成分总RNA的提取 按照Trizol说明书操作，提取的总RNA溶于去焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，测OD值，调RNA浓度为1 μg·μl-1，分装，然后-70 ℃冻存待用。 1.3.3 RT-PCR反应体系 取1 μl RNA，55～60 ℃孵育10 min以消除RNA二级结构,在冰盒上依次加入10×RT-Buffer 2 μl、25 mmol·L-1 MgCl2 4 μl、10 mmol·L-1dNTP混合物 2 μl、Rnase抑制物 0.5 μl、去DEPC水 8.5 μl、Oligo dT 1 μl、AMV逆转录酶 1 μl,总反应体积 20 μl；42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min,5 ℃ 5 min;-20 ℃冻存。 1.3.4 PCR反应 (1)25 μl PCR反应体系组成如下:5×RT-Buffer 5 μl、25 mmol·L-1 MgCl2 0.5 μl、上游引物(25 pmol·L-1) 1.0 μl、下游引物(25 pmol·L-1) 1.0 μl、Taq酶(5 U·μl-1) 0.25 μl、cDNA模板 5 μl、灭菌水 12.25 μl。(2)PCR扩增条件 :94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循环,72 ℃ 7 min。然后1％琼脂糖电泳，Image Master VDS