姜黄素衍生物对激活的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用_临床医学论文.docVIP

姜黄素衍生物对激活的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用_临床医学论文 姜黄素衍生物对激活的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用_临床医学论文 作者：李云鸿， 王银， 杨文君， 丁娟， 牟青春 【摘要】 目的 对比研究姜黄素(curcumin)及其衍生物对脂多糖(lipopolysacchar，LPS)激活的小胶质细胞一氧化氮(NO)的产生及诱导型一氧化氮合酶((inducible nitric oxide synthase，iNOS)表达的影响。方法 用LPS(1μg·mL-1)刺激原代培养的大鼠小胶质细胞，同时用不同浓度姜黄素及其衍生物F进行干预，应用免疫组化方法观察细胞活性;Western-blot方法检测iNOS蛋白的表达;用Caymans Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit检测细胞上清液中NO的含量。结果 LPS作用4 h后，iNOS蛋白表达明显增强，NO释放量明显增加;使用姜黄素干预18 h后，浓度在5μg·mL-1以上时可以显著抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达和NO的产生，但是姜黄素衍生物只有在浓度达到25μg·mL-1时才对iNOS蛋白的表达和NO的产生有明显的抑制效果。结论 姜黄素和它的衍生物都能够抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达以及NO的产生，但其衍生物的作用相对较弱。 【关键词】 姜黄素及其衍生物;iNOS;NO;LPS;小胶质细胞 姜黄素是从中药姜黄中提取的酚类物质。大量研究表明，姜黄素具有抗炎症、抗氧化、清除自由基等多种生物活性。目前姜黄素衍生物已成为国际新药开发领域的一个研究热点[1]。小胶质细胞是中枢神经系统长驻的巨噬细胞，在中枢神经系统的免疫反应中发挥核心作用。在感染因素如LPS等的刺激下，小胶质细胞被迅速激活。活化的小胶质细胞可诱导蛋白酶的激活，释放各种促炎性细胞因子，并生成大量活性氧和活性氮，iNOS便是其中之一。iNOS一旦被大量表达，其活性便可持续相当长时间，从而大量、持续产生NO，介导广泛的毒性作用，目前认为中枢神经系统炎症病人脑中反应性胶质细胞过度表达iNOS是造成神经元损伤的重要原因[2-4]。本研究对比观察了姜黄素及其衍生物对激活的小胶质细胞NO的释放和iNOS表达的抑制作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验材料 LPS、姜黄素、抗iNOS抗体、抗CD68抗体和抗GAPDH抗体购自Sigma公司;姜黄素衍生物由美国加州大学戴维斯分校邓文斌教授提供;NO测试盒购自美国Cayman Chemical公司。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 小胶质细胞的分离和培养 取1d龄的新生大鼠脑，去除结缔组织和血管，机械捣碎并通过70μm网筛过滤，分离的细胞种植到多聚赖氨酸包被的培养瓶中，培养于含20%小牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2恒温箱培养，每3d换1次细胞液。2周后，利用摇床振荡法分离纯化小胶质细胞，分离的小胶质细胞培养于含10%小牛血清的DMEM中。 　　1.2.2 免疫组化方法 小胶质细胞以1×106/孔接种于6孔板，内置无菌盖玻片，培养24 h后，LPS或药物处理18 h(用药物预处理细胞1h后加入LPS，共孵育18h)，吸去培养液，用预冷的PBS漂洗1次，4%多聚甲醛固定30 min;PBS漂洗3次;与小胶质细胞特异性抗体抗CD68(1∶200)孵育过夜，然后再用PBS漂洗5 min×3，最后加入荧光Alex-488偶联的辣根过氧化酶标记的二抗(1∶1000)，室温孵育1 h，PBS漂洗5 min×3，封片，在荧光显微镜下观察，摄片。细胞呈绿色者为阳性细胞，应用J EOR801D 形态学图像分析系统软件，每片随机取4个视野，记录阳性细胞数，与正常无LPS或药物对照组阳性细胞数相比较，计算细胞活性，细胞活性=实验组4个视野平均细胞数/对照组4个视野平均细胞数×100%。 　　1.2.3 药物处理 将细胞接种于6孔板，分为两个大组，分别为姜黄素组和姜黄素衍生物组。在每一组中，又分为8个小组，分别为无药物/无LPS、无药物/有LPS及不同浓度的药物(包括0.5、1、5、10、25，50μg·mL-1)和LPS组(浓度为1μg·mL-1，用药物预处理细胞1h后加入LPS，孵育18h)。每个点做6个平行，其中3个将做免疫组化分析。重复试验3次。 　　1.2.4 Western blot 细胞以1×106/孔接种于6孔板，药物处理18 h后，用Western blot分析细胞裂解上清液中目标蛋白的表达。裂解细胞，收集上清液用BCA法蛋白定量，取等量蛋白，10% SDS PAGE分离后将蛋白转至Nitrocellular膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭膜2 h，抗iNOS(1∶500)抗体