干扰VEGF表达联合放射线治疗食管癌细胞移植瘤的实验研究.pdfVIP

134 2009年全国食管癌综合治疗研究讨会论文集 干扰VEGF表达联合放射线治疗食管癌细胞移植瘤的实验研究 浙江省肿瘤医院放疗科十一病区 封巍、郑晓 河北医科大学第四医院放疗科 祝淑钗、王玉祥 目的：分别研究两种干扰VEGF表达方法联合照射对裸鼠移植瘤的影响，并观察各组裸鼠肿瘤病理组织学和 细胞庄物学特征的变化，为VEGF基因治疗联合放射治疗食管癌提供理论依据。 立裸鼠爪垫移植瘤模型，在裸鼠移植瘤照射结束后开始使用反义VEGF寡核苷酸加脂质体转染。将32只BALB／ 入反义VEGFcDNA的组与其它组相比较成瘤潜伏期延长、瘤体生长速度慢。照射后：在反义VEGFcDNA组：可以 看到TE一卜A组与TE一卜AR组肿瘤平均体积差别较小，而此二组与对照、单纯照射组差别较明显。反义组寡核苷 酸组： TE一卜AOR组与其它3组瘤体平均体积差别非常明显。两大组中：反义组与反义加照射组裸鼠体内TE一1细 胞的VEGFmRNA与蛋白表达产物相对光密度比值明显小于对照组和单纯照射组，凋亡增加。结论：抗VEGF治疗 可有效地抑制裸鼠移植瘤的生长，对增加裸鼠移植瘤放射治疗效果有一定作用。 关键词：食管癌：血管内皮生长因子：移植瘤：放射； 放射治疗是食管癌十分重要的治疗方法，如何提高食管癌的放射敏感性，改善食管癌患者的生存是大家共 同探索的目标。血管生成在食管癌复发、转移的中的重要作用越来越受重视。由于VEGF在血管生成中的特殊作 相关研究嘲，本文进一步拟采用两种抗vEGF基因方法联合放射线治疗裸鼠移植瘤，为vEGF基因治疗联合放射治 疗食管癌提供理论基础。 1材料与方法 I PlusSV DNA 1．1主要实验仪器和试剂限制性内切酶EcoR：限制性内切酶HindIII、wizardminipreps purificationsystem(Promega公司)：G418 流式 建成生物工程研究所)、鼠抗人单克隆抗体VEGF、Actin、FITc标记山羊抗鼠IgG抗体(SantaCruz公司，美 国)；透射电镜刖一12A(日本Co哪ut公司)60Co治疗机(山东新华医疗器械股份有限公司)。 1．2TE一1食管癌细胞株由河北医科大学第四医院科研中心提供。 学教研室金明教授惠赠。 1．4 5’—GCAGTAGCTGCGCTGATAGTG C一3’，由上海生工公司合成。 RT—PcR引物序列由上海生工生物有限公司合成和纯化，引物序列如下 2009年全国食管癌综合治疗研究讨会论文集 135 上游引物：5’-G从GTGGTG从GTTCATGGATGTC一3’ 下游引物：5’-CGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCC一3’ 扩增片段VEGFl21403bp，VEGFl65515bp，VEGF189607bp B—actin：基因扩增产物为838bp 上游引物：5’-ATCTGGCACCACACCTTCTAC从TGAGCTGcG一3’ 下游引物：5’一CGTCATAcTCCTGcTTGcTGATCCAcATcTGc一3’ 对PcR扩增产物进行定量分析，计算相对表达量，公式如下： VEGFmRNA表达相对值=VEGF光密度值／B—actin光密度值 western SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，用DAB显色后，进 blotting方法检测不同肿瘤组织的蛋白提取后， 行半定量分析，计算相对表达量。 流式细胞技术检测细胞凋亡：收集肿瘤组织制成单细胞悬液，固定24小时，调整细胞浓度为1×106细胞／ ml，铜网过滤后上机测定。MTT法按照说明书进行。 电镜准备：取肿瘤组织加入2．5％戊二醛一1％多聚甲醛混合液固定，1％锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切 片(厚度50一70nm)，透射电镜观察细胞情况。 1．5vEGF质粒转染TEl细胞方法