反相高效液相色谱法测定血浆辅酶Q-%2c10-含量地研究.pdfVIP

LC-119 反相高效液相色谱法测定血浆辅酶Qto含量的研究 江平1，2辛剑2郑育芳1王畅1石先哲1吴美慧3许国旺1+ (1中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中一tl,大连116011) (2大连理工大学化工学院大连116023) (3大连市中心医院大连116033) l 前言 辅酶Q10(coenzymeQ10’C0010)，又称泛醌，是一种重要的维他命样脂溶性物质，广 泛地存在于人体细胞中。CoQlo作为至少3种线粒体酶的辅酶，参与线粒体呼吸链上氧化磷 酸化反应中的电子和质子转递，是细胞能量ATP生成过程中不可缺少的组成成分。90年代 初在研究自由基化学时发现，C0010是～种重要的抗氧化物质，有保持细胞膜稳定的功能， 即能防止膜脂质过氧化和保持膜流动性。血浆中CoQlo水平的下降可以反映细胞生成能量能 力的下降，同时，人体组织中C0010的含量水平与很多疾病的发生直接或间接相关，因此， 对人体组织CoQio的含量检测具有重要的医学意义。 对血浆中COOlo的测定方法已有很多报道，其中主要采取光度法和液相色谱法。由于血 样基体复杂，其杂质峰往往严重干扰CoQlo的测定，Grossi等将固相萃取技术引入血样的预 处理，但他们所采用的SPE柱柱容量太小，不能保证COOl0和c009的完全富集。本文在此 基础上选用SPE柱净化血样，同时优化了血浆中COOlo测定的HPLC法的操作条件，使测 定灵敏度相比原文献有较大提高。将该方法应用于正常人血浆中COOlo的含量监测，为今后 开展CoQ—o的含量与疾病关系的研究准备了条件。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 SIL一10ADvp型自动进样器、SCL一10Avp系统控制器和ShimadzuClass—VP色谱工作站。色谱 Scientific)。 柱(100mg／2．5m1)(中科院大连化物所国家色谱中心)。真空歧管装置(美国Jw 称取2．5mgCoQ9标准品溶于正己烷，配成lOOmg／l的贮备液。 2．2血样的收集 所有血样由大连市中心医院提供。将新鲜血液注入装有肝素作抗凝剂的试管中，立刻在 温下熔解2h后，方可进行血浆的预处理。正常人经体检证明肝、肾、心正常后方可采样。 2．3血浆的预处理 正己烷重复萃取～次，合并萃取液。将7ml萃取液加入500mg硅胶SPE柱(预先用正己烷 活化，2ml水平衡)，经lmI甲醇淋洗后，3ml异丙醇洗脱。将洗脱液蒸干，溶解于O．3ml 异丙醇，取5ul按以下色谱条件进行分析。 2．4色谱条件 mmi．d×150 u 采用ODS2色谱柱(4．6 mm，5m．)，流动相为异丙醇／甲醇(V／V=45： 55)：流速为lml／min；检测波长^=275nm；进样量5ul。 3 结果与讨论 3．1SPE柱的选择 的保留时间处，均有峰出现。而500mg的SPE柱没有这种现象。冈此，本实验选用了500mg 的C18柱进行再一次同相萃取。血样经两次SPE净化后，二干二扰大大降低，见图1和图2。 图1． 未经SPE柱处理的血浆色谱图 圈2．经SPE柱处理的血浆色谱图 3．2操作条件的优化 考察了血浆在不同体积比例的异丙醇和甲醇溶液作流动相下的色谱行为。血浆经SPE 柱预处理后，内标CoQ。的干扰完全去除，而CoQ。o后仍有一干扰峰。当异丙醇：甲醇(体 全分开，保证了测定的准确性。血浆的色谱行为见图1。 3．3线性关系、精密度、加标回收率考察 同样的色谱条件下进行分析。结果表明，在O．1～50mg／l范围内，峰面积比(CoQlo：CoQg) 度比)。血样的最低检测限为O．03mg／l(信噪比为3：1)。 取相同的新鲜混合血浆，震荡摇匀后，取出5份，平行做5次，其结果为：O．75±0．02， 测定精密度(相对标准偏差)为3％。另取相同的新鲜混合血浆12份，4份加入0．1mlCoQlo 在上述条件F进行分析。其结果见表1。 表l方法回收率考察 样号 结(mean+_sd)应得结果(rag／1) 刚收率(％) 血样(n=5) 075±0