LC%2fMS%2fMS技术对西他沙星代谢物结构地研究.pdfVIP

LC一30 LC/MS/MS技术对西他沙星代谢物结构的研究 徐小平 王 曙贺英菊 陈 聪 中冈念’ (四川大学华西药学院，成都610041) 液相色谱一质谱质·谱联用 (LCIMS/MS)是在LC/MS的基础上发展起来的对质谱碎片离子进 行多级质量分析的色一质联用技术1[31。关于LC/MS/MS在药物分析中的应用，特别是在氟哇诺酮代 谢物研究中的应用近年已有不少的文献报道3,3〔]。西他沙星 (Sitafloxacin，代号DU-6859a)是日本 第一制药有限公司继左氟沙星后开发出的一种强力广谱新氟喳诺酮类抗菌剂，对革兰氏阳性球菌、 革兰氏阴性菌以及厌氧菌的抗菌活性是左氟沙星的4-32倍W71。对肺炎球菌DNA促旋酶和拓扑 同功酶有双重抑制作用1810临床表现有宽抗菌谱，特别是对呼吸道的病菌有极强的抗菌活性191。本 文应用LC/MS/MS技术对西他沙星的代谢物进行了结构研究，并以代谢物D:为代表就该技术的 应用进行了讨论。 1试药和仪器 1.1药品与试}r}J DU6859a由日本第一制药有限公司提供:其它试剂皆为分析纯。 HP1050HPLC仪，FinniganMatTSQ700型MS/MS仪。AS-8010自动进样器，WATERSTCM 柱温箱，岛津C-R4A数据处机，NTS-1300恒温振荡器，NS-8旋涡震荡器，ELVISEL摇摆振荡 器，EC-57C真空离心机，05PR-22低温离心机，超声清洗机(Japan). 1.2 样品的预处理 (1) 尿样的提取:取尿样适量，用50mmoUL的醋酸盐缓冲液 (pH5.0)适量稀释，将稀 释样品直接转入固相萃取柱，用水清洗后，再用少量HZOrFHF(1:1)将柱中的待测定组分洗脱 并收集、真空挥干，即得。 (2) 胆汁样的提取:取胆汁样适量，用l0/ONaOH液调节pH至11，室温放置反应lh，用 100/.HCI调节pH至2,然后用乙酸乙醋提取，合并有机相并挥干，即得. 2 分析条件 2.1色谱条件 色谱柱:InertsilC:柱 (250mmX7.6mm,5“m),流动相:CH,CPU5mmol/LK2HP0,(pH6.8) (25:75):流速:1.OmUmin:柱温:30C;紫外检侧波长.t=285nmo 图t尿中西他沙星及其代谢物 A.HPLC图,B.D2MS图卜C.D2IMS/MS图。 雄日本第一制药 (株)代谢研究所. 2.2质谱条件 ESI方式:辅助气 (auxiliarygas)15mLlmin;输送气 (seathgas)492kPa;毛细管温度1500C; CIDAr240-333Pa:能量-25eV;EMULTI1000V。口服西他沙星后人尿提取物的色谱图和代谢物 D2的质谱图、质谱I7}谱图见图la 3 结果 口服西他沙星后人尿经HPLC分离 (见图IA)，得到西他沙星及其代谢物的色谱图，并观察到 可能的代谢物峰。同时获得的还有西他沙星的MS图 如〔图1B)和MSIMS图 (如图1C)。以代 谢物D2为例，其相应的MS图(见图2A)中分子离子峰 [M〔+H]*)由原药的409，变为D2的408.9 推测为分子中的氨基被氧化代谢为碳基:此时对其MM/SS 图比较分析表明，代谢物马在失去五 元支环后体现出与原药碎片离子峰297相同的峰，失去一分子水后，其碎片离子峰有别于原药失 水的碎片离子峰。说明代谢未发生在母环，原药与D2分子量相差to 4 讨论 4.1色谱特征 由于代谢物具有的复杂性和未知性，须通过色谱分离技术分离原药与代谢物以及生物样中共存 的其他杂质。保证了代谢物MS图与原药MS的独立性和特征性。 4.2 MS特征 代谢物具有的微量性和未知性还同时要求在高灵敏度的条件下在线识别分子结构，利用在线质 价 谱图对未知代谢物分析，如图IAD2的MS图。并且通过Ms/Ms图可对未知物的分子离子碎片 峰进一步剖析，确定代谢部位和代谢类型，如图1B 几的Ms/Ms图，表现出在打掉支环后母环 的碎片峰二/Iz297与原药去掉支环后的母环碎片离子峰一致;而母环上失水后的碎片离子峰代谢物