灵芝多糖抗角质形成细胞衰老相关基因表达地研究.pdfVIP

灵芝多糖抗角质形成细胞衰老相关基因表达的研究宰 谢韶琼廖万清 长征医院皮肤科(200003) 摘要 目的：检测灵芝多糖抗皮肤细胞衰老基因表达水平，阐明古老的抗衰老中药“灵芝”的抗衰老机 理。 后激光共聚焦扫描获取图象，用特殊的计算机分析软件进行图象分析获取数据。结果在所检测的 一些基因表达水平有显著改变。 结论：通过这些上调和下调基因的功能分析可看出，灵芝多糖有促进细胞的生长，对抗表皮细胞衰 老的作用。 关键词：灵芝多糖；皮肤衰老；基因芯片；角质形成细胞 灵芝是一种古老的中药，也是一种食用真菌。历代医家认为灵芝具有延年益寿等功能，但仅基于 经验性总结。灵芝多糖是灵芝中的主要活性大分子物质，现代研究证明灵芝多糖具有抗肿瘤、降血压、 降血脂、保肝、清除自由基等作用，而对皮肤衰老相关基因表达及其表达水平的影响，未见文献报道。 角质形成细胞是人体表皮的主要细胞，占表皮细胞的80％以上，近年来，由于角质形成细胞体外培养和 在体外进一步分化方法的成功建立，并且体外培养的细胞和体内生长的原细胞具有同样的形状、结构 和功能，以及细胞分子生物学技术的发展，使得药物抗衰老的研究能在体外多方面、多层次进行，其具 有体内研究类似的生物科学价值，也可作为体内研究的基础。经研究证明过氧化氢(H：O：)是很好的 细胞衰老诱导剂，为了全面分析灵芝多糖延缓衰老的作用机制，本文通过上海生物芯片公司提供的人 照，共18346条基因，检测灵芝多糖抗H：0：诱导角质形成细胞衰老的各种基因的表达水平，并与未用 基金项目：中华医学会一欧菜雅中国人健康皮肤研究项目(2005020623) 作者单位：200003上海，第二军医大学附属医院，上海市长征医院皮肤科 qing@sohu．corn 药物的对照组比较，从分子学水平分析灵芝多糖可能的抗衰老作用机理。 材料和方法 一，角质形成细胞培养和药物作用 将角质形成细胞系HaCaT(由长海医院皮肤科购于美国国立卫生研究所，惠赠我科)用含10％胎 至80％融合时，进行传代分瓶培养，直至分成4瓶。将细胞分成2组，每组2瓶，待细胞长至60％一 70％融合时用含2％胎牛血清的DMEM培养基饥饿培养12小时，然后进行不同组处理。灵芝多糖(由 养液于上述孵箱巾孵育，每隔l天作用1次，共3次；对照组(co组)：不用灵芝多糖作用于细胞，将培养 2％胎牛血清的DMEM培养液于上述孵箱中孵育，每隔1天作用1次，共3次。 二、总RNA抽提、纯化和质量检测 5X GEN 三，探针备制和芯片杂交 NucleotideRemoval 主要步骤：1．荧光探针的制备(cDNA第一链标记。2．用QIAquick Kit进行荧光 记。4．芯片杂交、洗涤。 四，数据处理 主要步骤：1．通过激光共聚焦扫描仪获取16一bittiff图像文件。2．将图像导人图像分析软件，定 量转化为数值。3．对Cy3和cy5的原始提取信号进行均衡和修正，进一步分析实验数据，计算得到m— 表达差异。 五、实时荧光定量聚合酶链式反应 sybr ex RT·PCR premixtaq kit反应体系。(4)对所获得的real time—pcr数据进行了统计和分析，得到不同样 本相对于不同基因的Ct值，计算出药物组和对照组基因表达水平的差异。 表l 6条基因的引物 基因 上游引物 下游引物 LUM TCATCCCT蜘BAGC7rGGAT ACTB -I．IG∞队CAGGAAG，I℃CC7n1GCC BIRC5 ATAAAGCCGTAGGCCC’rrGTC PLKl ACAGTCTCAATGCCTCCAA