PCR检测质量控制.pdfVIP

PeR检测的质量控制 孙明博士 农业部兽医诊断中心 随着兽医防疫工作重要性的逐步提高，PCR检测技术已被兽医工作者比较 广泛认可，已经从实验室研究走进了临床应用阶段。如何提高PCR检测质量， 已成为实验室技术人员不可回避的一个问题，它直接影响实验室检测结果的可信 度和兽医防疫工作质量。 农业部兽医诊断中心用PCR检测、诊断疫病已4年多了。在实际PCR检测 应用中，逐步得到了客户的认同，PCR检测数量逐年明显增多。最初每月只检 几十份，现在有时每月检测1000多份。我们积累了一些PCR检测经验，特别是 对PCR检测质量控制方面有一些自己的体会。 我们认为，PCR检测质量的控制是一个系统工程，总体上涉及三个方面：一 是试验仪器；二是试验试剂与耗材；三是人员操作。任何一个方面出现问题，都 会影响PCR检测质量。 一、试验仪器 PCR仪和紫外凝胶成像系统(紫外分析仪或手提紫外等)以及移液器都可 能影响PCR检测的质量。PCR仪是控制PCR反应温度变化的，其温度和控制时 间的准确程度可能会影性PCR检测质量。移液器取液的准确程度影响反应体系 是否能达到最佳反应环境。紫外分析系统对检测敏感性有明显的影响。紫外分析 系统有3种类型仪器：紫外分析仪、紫外凝胶成像系统、手提紫外灯。紫外分析 仪直接用眼睛观察琼脂糖凝胶上DNA扩增带。紫外凝胶成像系统是在计算机上 通过摄像系统对琼脂糖凝胶上DNA扩增带进行观察。手提紫外灯可以在电泳过 程中直接对琼脂糖凝胶上DNA扩增带进行观察，使用方便，分辨率比较低。依 据这些仪器的分辨率由高到低顺序是紫外分析仪、紫外凝胶成像系统、手提紫外 灯。紫外分析仪有时能看到弱阳性扩增带，在紫外凝胶成像系统上却看不到。手 提紫外灯只有在阳性扩增带比较亮时才能看到，建议为保证检测质量最好不用手 提紫外灯，可用于临时的电泳结果观察。 仪器的质量控制应该通过实验室质量认证来实施，定期进行仪器的效验。没 有质量认证的实验室可以定期请仪器生产厂家进行效验和保养，确保所有仪器处 于正常的工作状态。 二、试验试剂与耗材 在PCR检测质量控制中，试剂的选择具有十分重要的作用，也是实验人员 最为关注的检测质量控制因素。试剂一定选择质量和信誉好的厂商，一但选定后 最好不要轻易改换。如果必须改换时应与原产品进行严格比对试验，包括敏感性、 特异性、试剂保存期等试验。并且经常要注意不同批次产品质量的差异。比如说 TaqDNA聚合酶，不同厂家生产的质量是有差异的，尽管都是标出相同活性单位， 但其标定方法和保存液的成分以及运输过程的不同常常导致实际活性单位是有 差异的，有时由于其活性低，使得弱阳性样品漏检；有时由于其活性过高出现非 特异扩增。这与ELISA检测中酶结合物的作用相似。其实影响PCR检测结果的 试剂很多，可以这样说，PCR检测用的所有试剂都可能影响检测效果。控制试 剂的质量是作好PCR检测前提。我们认为：最好是选择PCR试剂盒来控制试剂 质量。 评价一种PCR试剂盒，除了考虑它的敏感性、特异性、稳定性、操作简便 程度外，还应包括：试剂盒提供的试剂覆盖整个PCR检测试验的程度。如果试 剂盒提供了整个PCR检测试验的试剂，表明该试剂盒对PCR检测试验的试剂具 有了全程控制性能。相反，PCR检测的试剂的质量控制程度比较低，意味着检 测质量可控程度低。例如：溴化乙锭仅仅起荧光染料的作用，如果在阳光下长时 间的照射下失效了，在紫外灯下发荧光效能降低，可能会造成一些弱阳性样品的 漏检，出现假阴性。其它试剂出现问题也是一样影响检测质量。试剂盒在生产过 程中，有一套试剂生产质量控制体系。每一试剂组分都经过灵敏度、敏感性、特 异性质量控制的检测，在有效期内能确保每种试剂的质量。因此，选择试剂盒进 行PCR检测是比较理想的控制方法。在PCR检测中，最好全部使用试剂盒提供 试剂，对PCR检测质量控制有益。 实验耗材也是影响PCR检测质量的因素之一。PCR反应管薄厚以及传导热 量性能等直接影响PCR检测效果。在热盖PCR仪上一般不需要加入矿物油，但 有些PCR反应管盖子不严密，导致扩增过程中反应液水份蒸发，严重影响检测 灵敏度。PCR反应体系是微量的，移液器的Tip头生产质量不好时，有时致使液 体残留量多或洪吸作用强，导致试剂盒中试剂量不够，配置PCR反应体系不准， 造成检测质量下降。 在每次PCR检测时，一定