血清1、2、4与5型鸭疫里默氏杆菌的RAPD研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集(2004年) 血清1、2、4和5型鸭疫里默氏杆菌的RAPD研究 汪铭书n程安春-李淑梅2陈孝跃1 (L四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心，动物疫病和食品安全评价四川省重点 实验室，四川雅安，625014； 2．河南职业技术师范学院，新乡，453003) 本文以37℃摇震培养和烛缸厌氧培养从12种培养基中选择出鸭疫里默氏杆菌的最优 培养基和培养条件，以血清1、2、4和5型的鸭疫里默氏杆菌代表株AI、A2、A3和A4为 研究对象，培养增殖后分别提取基因组DNA，利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其 基因组进行DNA分析，从20条随机引物中筛选出8条随机引物，能在这四种血清型的鸭 疫里默氏杆菌中有较好的多态性，可作为分子标记鉴别四种不同血清型的鸭疫里默氏杆菌， 同时还筛选出能在四个血清型的鸭疫里默氏杆菌代表株均出现相同的特征条带而对照菌大 肠杆菌、沙门氏菌无该条带的随机引物，为鸭疫里默氏杆菌病的分子诊断提供基础。 关键词：鸭疫里默氏杆菌RAPD鉴别 鸭疫里默氏杆菌(Riemere]la Anatipestifer，RA)病是鸭、鹅、火鸡和多种其它鸟类 的一种接触性传染病。该病呈急性或慢性败血性过程．以纤维素性心包炎、肝周炎、气 囊炎、干酩性输卵管炎和脑膜炎为特征llI．1-8周龄鸭高度敏感，发病率高．达90％以上， 尤以2-3周龄的雏鸭为高；死亡率受多种因素的影响差异很大，高者可达60％一75％，该 病给养鸭业造成巨大的损失”一I。准确的诊断是养鸭生产中预防鸭疫里默氏杆菌病的关键 措施之一。由于该病血清型多，而且前国内只有个别实验室拥有鸭疫里默氏杆菌的全部 血清型．因此传统的血清学诊断方法在血清型不齐备的情况下就无能为力。分子生物学 的发展为解决这个问题提供了可能，但目前对鸭疫里默氏杆菌的分子生物学研究较少。 故我们对生产中流行最为广泛的血清l、2、4和5型RAPl进行了随机扩增多态性DNA (RAPD)的研究，以期对鸭疫里默氏杆菌的以分子生物学研究提供依据，并探索RAPD 用于鸭疫里默氏杆菌病诊断的可行性。 1材料与方法 1．1试验菌株 株由四川农业大学禽病中心分离并鉴定；参考菌株鸭沙门氏菌S(satmonella．血清型 3，10：e，h：l，6)和大肠杆菌E(Escherichia coli，血清型0128))由四川农业大学禽病中心保存。 1．2主要试剂 胰酶大豆肉汤(TSB)为difco公司产品．购自华美生物工程公司；蛋白酶K为Merek ’本硬譬获西j1}省应用基础研究硬日f籀号03JYOZg一035一1)资助 作者筒舟：汪铭书(1964年一)，女．博士，教授，主要从事微生物和分子生物学的教学和研究工作。 360 中国畜牧兽医学会对物微生态学分会第三届第七次学术研讨套论文集(2004年) ladder DNA marker为宝大连 公司产品；1’aq酶、dNTPs为上海生物工程公司产品；100bp 生物工程有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。 1．3随机引物 购自北京赛百盛公司，其编号和序列见表l。 表1 随机引物编号及其序列 1．4培养基乖培养条件的选择及细菌培养“-耵 鸭疫里默氏杆菌经血平板活化培养后分别接种于普通肉汤、普通肉汤+水解乳蛋白、 普通肉汤+酵母抽提物、普通肉汤+小牛血清、普通肉汤+酵母抽提物+小牛血清、胰酶大 豆肉汤、胰酶大豆肉汤+水解乳蛋白、胰酶大豆肉汤+酵母抽提物、胰酶大豆肉汤+小牛血 清、胰酶大豆肉汤+酵母抽提物+小牛血清、P．L肉汤、P．L肉汤+小牛血清12种液体培养 基中，37℃摇震培养和烛缸厌氧培养36小时．测定每种培养物OD，。．OD值最大者选择 为鸭疫里默氏杆菌最优培养基和培养条件。 1．5细菌总DNA的提取 按最优培养基和培养条件培养鸭疫里默氏杆菌，取新鲜液体培养物500“1于15ml 分钟。最后用Tris饱和酚、酚／氯仿，异戊醇(25：24：1)及氯仿／异戊醇(24：1)各抽提