纯化Vero细胞乙型脑炎减毒活疫苗地研究.pdfVIP

纯化Vero细胞乙型脑炎减毒活疫苗的研究 吕文利程晓毅赵新华 田小凤张渡(武汉生物制品研究所，武汉430060) 【摘要】!乙脑疫苗是我国基础免疫的主要生物制品之一，乙脑病毒感染人体后遗症严重，死亡率也较高，而注 射疫苗是唯一有效的预防方法。乙脑疫苗的生产工艺经历了鸡胚培养疫苗、鼠脑疫苗、原代地鼠肾灭活疫苗和原 代地鼠肾减毒活疫苗，以及少量的Veto细胞纯化灭活疫苗。目前．在国内多使用原代地鼠肾减毒活疫苗，该疫苗的 注射剂量小．副反应少，也具有较好的安全性和有效性，但在制备过程中．由于使用的地鼠肾原代细胞，这就存在一 个高污染的问题以及受到动物源性的各种不明外源因子的影响。为了减少污染及外源因子的影响，制备出具有更 好免疫性、更安全和更经济的乙脑疫苗．我们尝试着使用Vero细胞来制备纯化乙脑减毒活疫苗。I 取出冻存Vero细胞复苏后按照一定比例进行传代扩增于克氏瓶中，待Veto细胞长成致密单层后，接种乙脑减 毒株SAl4-14-2毒种，待病毒吸附后再加入无血清199培养液，进行培养，培养数日后收取病毒液。将收集的病毒液 经离心后，病毒液用10万分子量流动超滤器超滤浓缩适宜倍数，浓缩后的病毒液用鱼精蛋白硫酸盐处理成最终浓 度为2r,瞩Cm]，此病毒鱼精蛋白混合物放置于4。C．2小时后离心沉淀出鱼精蛋白。将上清收集于灭菌的瓶中，再用 凝胶过滤介质Sepharooe4FF纯化疫苗。用PBS冲洗层析柱后上样，收集病毒峰的液体，密封后贮存于4℃。取纯化 疫苗进行乙脑病毒的鉴别试验，将待检纯化苗用细胞生长液稀释至终浓度为1旷。或10～，乙脑病毒免疫血清用细 胞生长液溶解复原．豚鼠阴性血清用细胞生长液稀释，将稀释的疫苗与免疫血清混合，同时，稀释的疫苗也与豚鼠 阴性血清混合，置37℃帅分钟。将发育良好的BltK细胞弃去液体，将中和样品接种六孔板单层BHK细胞0．捌， 同时设正常细胞对照2孔．置卯℃孵箱吸附。甲基纤维素覆盖，6天后染斑，结果试验组完全中和投有蚀斑出现； 阴性对照有蚀斑出现；正常细胞对照无蚀斑出现。证实为乙脑病毒。应用蚀斑法测试病毒滴度为70I州】／rnl。 用10～12克小自鼠做免疫原性检查的结果为Ⅱk为10～PFU，攻击对照组小白鼠死亡率为90％。外源因子检查阴 性；脑内致病力试验小白鼠全部健存；乳鼠传代返祖试验2．3LgLDso／0．03ml，小于国家规程规定值3．0LgLIk／ o．03ml；对比纯化前后的蛋白含量，蛋白的去除率大于95％；DNA含量检测为o5n异，ml。 根据以上的检测与现存的乙脑疫苗比较，经纯化后的疫苗的免疫性和安全性更好。因此，用这种方法和材料 有望生产出一种更安全和有效的乙脑减毒活疫苗。 【关奠词】乙脑活疫苗vero细胞纯化 乙脑病毒广泛分布于中国、印度、越南、缅甸及 于使用地鼠肾原代细胞，而在目前未普遍使用SPF 西太地区一些国家，此病毒由蚊虫传播给宿主，如 动物的情况下，存在着污染高的问题，还有动物源性 人，猪等。感染后．非人宿主常有高毒血症，但无症 的各种不明外源因子的影响；而乙脑灭活疫苗虽然 状，这就成为病毒的自然宿主。而在人毒血症低，亦 效果稳定，但注射次数多，副反应较多，也不是理想 常无症状，只有少数可发生脑炎，其中有20％死 的乙脑疫苗，因此我们尝试使用Veto细胞培养乙脑 亡，也有许多人发生严重长期神经性后遗症。因此， 减毒株，以期制备一种新一代的更安全、有效的疫 对有可能感染的地区的人群唯一的办法即为接种有 苗，并取得了相当的进展。 效的、安全的疫苗。乙脑疫苗的生产工艺经历了鸡 材料与方法 胚培养疫苗、鼠脑疫苗、原代地鼠肾灭活疫苗和原代 地鼠肾减毒活疫苗，以及少量的Veto细胞纯化灭活 1．材料 疫苗。目前，在国内多使用原代地鼠肾减毒活疫苗 (1)毒种：乙脑减毒株SAl4．14．2，由中国药品生 和原代地鼠肾灭活疫苗。。而在欧、美等国使用的是 物制品检定所购得，由我所乙脑疫苗室保存，原代地 一种经批准的日本产精制灭活鼠脑疫苗(JE．Vax)。鼠肾细胞传至PHk代。 其所应用的毒种为强毒，此疫苗于泰国大量