转基因油菜中几种重要防御酶活性变化规律的研究.pdfVIP

转基因油菜中几种重要防御酶活性变化规律研究 王新发1 王汉中1 刘责华2 胡赞民2郑元本 1．中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物遗传改良重点实验室 100151 武汉430062；2中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 菌核病是我国油菜生产中的最主要病害，尤其在长江流域油菜主产区发生最严重，成 为了我国油菜生产的最主要限制因子之一。利用基因工程将抗病基因导入油菜，使其获得 对病菌感染的抵抗能力，是目前植物抗病遗传育种中一种较为有效的方法。我们利用农杆 菌介导将几丁质酶和0—1，3-葡聚糖酶双价基因导入油菜中，获得了转基因植株。近年来， 人们对多种植物感染病菌后的某些酶活性的变化规律进行了深入的研究，其活性的变化， 特别是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine dase，P00)等活性的变化，与植物抗(耐)病性有关。本研究对转基因油菜及未转基因 油菜(对照)与中抗品种、感病品种进行了上述5种酶活性变化规律的比较研究，初步探 讨其抗萤核病的机理，并从酶活性变化分析转基因植株中外源基因的表达水平。 1材料与方法 1．1实验材料 转基因恢复系棚40一4、栅40—12与对照未转基因恢复系棚40，转基因保持系96B一 2及对照来转基因保持系96B、双高中抗品种中油821、感病品种中双3号(刘胜毅提供)； 菌核病菌核由农业部油料作物遗传改良重点实验室提供，在PDA培养基上培养核盘菌菌 丝。根癌农杆菌(Agrobacterium P“6。(含菜豆碱性几丁质酶基因和烟草碱性pI，3-葡聚糖酶基因)，由中国科学院遗传与 发育生物学研究所胡赞民实验室构建。 1．2苗核病菌核培养与接种 病原菌培养：将表面用0．1％升汞灭菌LO分钟的菌核接种于马铃薯培养基(PDA) 上，22。C恒温3—4天，长出的菌丝转接到新的PDA上，2～3天后取平板边缘的菌丝块 (用打孔器，螗ram)备用。 菌丝块接种：在油菜开花前，每处理取同一部位叶片，将叶片放人白磁盘，每盘两组 随机排列，每组8片叶，叶柄用湿纱布保湿。菌丝片倒置于叶片的主脉上部叶肉。每个品 再(植株)设2个重复不接种菌丝块作为对照组(cK)，2个重复则在每叶叶面接种一带 菌丝的琼脂块为处理组，置培养室中，用透明塑料薄膜覆盖保湿(100％)。22～23℃ 温育。 转基因油菜中几种重要防御酶活性变化规律研究 319 1．3取样 取样测酶活性：每次分别在相同部位取未接种(对照组CK)和接种的叶片各O．59， 每隔12小时(O～72小时)取样一次，每组2个重复均取样。 1．4试剂的配制 ———————————一—————————————一——————一 蟹壳几丁质粉制备胶状几丁质：参照Bolhr，周乐聪的方法进行。将蟹壳几丁质(sig— 烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37％，混合物的粘 度迅速增加，在几分钟以内粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。当几丁质基本上溶解完 毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒人3200ral预冷(5℃)的蒸馏水中，搅拌，几分钟内几 丁质沉降，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬浮液至冰箱(5℃)沉降过夜。倒 掉上清，剩余部分用双层中速定性滤纸或细菌滤器(0．22／-m孔径)抽气过滤，沉淀用蒸 馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴NaOH使溶液呈中性。将上述无酸沉淀物加 到200ml蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶状几丁质溶液。取样5ml，105℃烘箱中干 燥至衡重，测出溶液中几丁质的含量。 DMAB溶人70ml冰醋酸和 二甲氨基苯醛(DMAB)试剂：1体积DMAB储存液(89 lOml浓盐酸中)与9体积的冰醋酸混匀，即配即用。 3，5一二硝基水杨酸(DNS)试剂：称取lOgDNS，苯酚29，亚硫酸钠0．59，四水合酒 000ml。 2％NaOH溶液中，然后用ddH’O稀释至1 石酸钾钠2009，全部溶入500ml 1．5酶活性的测定 PAL粗酶液提取及活性测定参