多相酶膜反应器合成生物活性肽地研究.pdfVIP

多相酶膜反应器合成生物活性肽的研究+ 姜忠义贾琦鹏刘家祺陈洪钫 ，(天津大学化工学院．天津300D72) 一／4 关键词 多相酶膜反应器治r成生物活性肽 引 言 生命科学中的许多现象与生物活性肽的性质密切相关，因此生物活性肽的高教生产技术 已日益成为世界范围内的研究热点。迄今为止．生物活性肽的合成主要有下述三条途径：(1)重 组DNA技术；(2)化学合成法；(3)酶促合成法。酶促合成法则在寡聚肽(短肽)的合成中 最具优势。 本研究选择在多相酶膜反应器中合成具有生物活性的二肽为研究对象。多相酶膜反应器 具有F述特点： (1)膜作为酶固定化的优良载体使酶在类似自然的环境下高效地发挥作用； (2)反应产物通过膜不断地分离出来，从而使酶促反应始终维持在适宜的动力学或热力 学条件下进行，并可同时实现产物浓集； (3)采用膜萃取避免了乳化和破乳过程。也摆脱了返混的影响和液泛的限制； (4)过程集成化使设备费节约．且使设备有较大的变通余地： (5)分离、浓集的能量源自反应过程的化学自由能而无需外部供给，使操作费用降低。 1实验部分 1．1原料 Ⅳ．乙酰．苯丙氨酸(由天津市氨基酸公司提供的粗品纯化，分析纯)．厶亮氨酰胺、￡一甘 彝酰胺、L．丙氨酰胺、￡．苯丙氨酰胺、L一缬氨酰胺、脂肪酶、正辛醇(Sigma公司，分析纯)， 磷酸盐、无水乙醇、苯、四氢呋喃、戊二醛、异丙醇等均为市售分析纯产品。 选用聚丙烯腈中空纤维膜为过程用膜材料，膜的平均截留相对分子质量卯000。多相酶膜 反应器的基本参数见表1。 表I多相酶膜反应器结构参数 ． ． 一 型巴堡 型塑里 !d璺巴 望!!尘 ￡ ! !1 1．2^r_乙酰一苯丙氨酸乙醅的合成 采用氯化氢法进行Ⅳ，乙酰-苯丙氨酸乙酯(APEE)的合成。 称取一定量的Ⅳ．己酰苯丙氨酸加入到圆底烧瓶中，再倒入一定比例的无水乙醇，用冰盐 浴将混合液冷却至O℃以下，并不停搅拌。向烧瓶中通入干燥氯化氢气体直至饱和，反应2h 左右。反应混合物低温放置过夜后进行旋转蒸发得到黄色油状物。将油状物用尽可能少量的 无水乙醇溶解，然后再加入4-5倍于乙醇体积的蒸馏水，低温结晶。晶体通过抽滤收集，再 进行真空干燥，得到白色针状晶体。 通过熔点测定和红外光谱分析进行鉴定。 1．3二肽的酶促合成 r·min。搅拌下反应，直至气相色谱检测没有乙醇为 加入5克脂肪酶。悬浮液在37℃和300 止。所得沉淀过滤出用溶剂洗涤，再用温热乙醇萃取。旋转蒸发除去乙醇后，用5％碳酸氢 钠和水洗涤。在甲醇中结晶，通过薄层色谱或高效液相色谱进一步纯化。二肽的组成通过元 素分析和质谱分析确定，井进行熔点测定。 1,4酶的固定化 588 将异丙醇通入膜组件的管程和壳程，使膜充分浸泡后排干，在空气中静置数小时，把溶 于磷酸缓冲液的酶通八壳程，循环超滤．再用戊二醛溶液作交联剂使酶固定于膜上，最后， 用新鲜的缓冲液冲洗膜装置，阻去除游离酶及其他杂质。以不同浓度异丙醇一氢氧化钠的混台 溶液为清洗剂进行变温清洗，酶膜可以方便地再生。 1．5实验流程 图1实验溉程 三一氨基酰胺 实验流程见图1，APEE的正辛醇溶液从中空纤维膜的管程通入并循环· 的的磷酸盐缓冲液(pH=7．8)从中空纤维膜的壳程通入并循环。两股进料液扩散进入膜孔后， 由固定在膜中的脂肪酶催化而生成二肽。多相酶膜反应器的温度维持在37℃·为防止发生相 间泄漏．膜器的管程和壳程保持一定的压差。定期对两股料液进行取样分析a 1．6分析方法 HPLC 色谱仪：Waters 固定相：C。。 柱温：室温