自身免疫性睾丸炎对精子特异性酶与生育功能影响的研究.pdfVIP

自身免疫性睾丸炎对精子特异性 酶和生育功能影响的研究 上海市中医药大学附属龙华医院(200032)陈磊夏卫平周智恒 材料和方法 l、材料 雄性豚鼠12只上海中医药大学实验动物中心提供。 2、精子顶体蛋白酶、透明质酸酶和乳酸脱氧酶测定 】．精子顶体蛋白酶测定：取豚鼠尾部精子调节精子密度至1×106删，用pH7．3H强冲洗沉淀 精子2次后，换新鲜PBS于36℃恒温箱内放10～15分钟。取含有活精子的悬浮液孵育及Ze随 LSM510激光共聚焦显微镜镜检，采用固定明胶底物薄膜法，计算精子顶体酶活性反应区直径。 2．精子透明质酸酶测定： 下离心10分钟，取上清液待测定。 加入001 测光OD值。 (3)以N—AGA作标准曲线，建立标准N—AGA光吸收变化率，得出标准曲线(回归方程Y= 0．∞『)(一O．01)。酶活力(u)=1urnolN—AGA／T。 3．精子乳酸脱氢酶测定 (1)取豚鼠尾部精子调节精子密度至1×106／“．放人一20℃冰箱内冷冻1小时，取出让其自 然融化。然后再重复一次此过程。温室解冻后，在冰浴中超声匀浆3×30秒，10000r／商n条件下 离心10分钟，取上清液待测定。 (2)U)H—cl活性的测定：采用2一酮基己酸为底物的酶动力学分光光度法。 (3)u)H总活性的测定：采用以丙酮酸钠为底部代替2一酮基己酸外，其余条件和操作均与上 相同。 3、计算机辅助附睾精子分析： ． 参照1’ayl。r，CT的方法。解剖豚鼠取附睾尾部，置于2ml删d液中剪碎，37摄氏度恒温5分 钟。取上清液O．02m1，加入0．38ml，送mM一ⅣOS自动精液分析仪精子分析检查，测定的精子参 数：精子数量、存活率、活动力和直线运动。 4、组织学观察 (1)睾丸病理学检查： 取左侧睾丸用b。uin液固定24小时，石蜡包埋，HE和PsA染色，JohnⅫs积分法定量分析曲 细精管的面积及各期生精细胞的变化。 (2)睾丸电镜检查： 取右侧睾丸，将其切成1Ⅻ一的组织块，采用25％的戊二醛行前固定，用0．1M二甲砷酸钠缓 冲液配制的I％锇酸溶液(pm．4)固定两小时，固定过程温度保持在4摄氏度，固定后用递增浓度 ·7】 · 的序歹9酒精脱水，用环氧树脂Epon618包埋液，进行浸透和包埋，超薄切片经醋酸铀及柠檬酸铅染 色，H600电镜观察。 结果 1、实验性变态反应性睾丸炎对精子特异性酶的影响： 实验结果显示：实验性变态反应性睾丸炎严重损伤精子顶体酶活性，造成造模组顶体蛋白酶阳 性反应率下降、反应区直径缩小；透明质酸酶活性明显下降明显；u)H—Q和LDH总活性均明显 低于空白组低于空白组(P0．01)，详见表(1) 表(1)顶体蛋白酶情况 注：t迪模妞与空白蛆比较P001。 2、对肿睾尾郜精干盾量的影响： 实验性变态反应性睾丸炎造成附睾尾精子的数量、存活率、活动力和直线运动各项指标下降， 其中槽子数量、存活率和活动力比较有显著差异(PO．01)，见表(2)。 表(2)豚鼠附睾精子质■ 注：*造蠖扭与空白姐比较PO．01。 3、对豚鼠睾丸和附睾重量的影响： 各组治疗后睾丸附睾重量情况见表(3)，造模组睾丸附睾重量较空白组显著减轻(P0毗)。 表(3)豚鼠搴丸和附睾重■(x±s}克 注：·迫模姐与空白比较P0．01o 4、组织形态学变化： 1．光镜变化 空白组呈正常的组织结构，曲细精管内可见了各级生精细胞及支持细胞，排列规则，管腔面有 很多精子，并可见精子嵌入精子细胞间，曲细精管界莫及间质也无明显异常。 造模组表现为混合性损伤：(1)生精阴滞：生精细胞发生阻滞于精原细胞、精母细胞阶段。(2) 生精细胞退行性病变：生精细胞剥落，排列紊乱，曲细精管管腔中有大量成团的未成熟和生精细胞， ·72· 充塞于腔面。(3)支持细胞综合症：曲细精管生精细胞完全，生精上皮仅由支持细胞组成。曲细精 管管腔较空白组缩小，腔面内见脱落变性生精细胞的残留。