微波加热破壁提取猪血超氧化物歧化酶地研究.pdfVIP

微波加热破壁提取猪血超氧化物歧化酶的研究木 修志龙王成陆美卿 (大连理工丈学生物工程系，大连116012) 齐东健 (大连市沙河口区卫生防疫站) 摘要本文采用截囊破壁法从猪血缸钿胞中提取超氧化物歧化嶂，站台相离子对其活挂的保护咔乍用， 在藏得较高的提取收率的朗时，肆的比活比水溶胀法提高了286倍．速到了快速、高鼓的提取此化目 的． 美t词趣氧化轴歧化肆．截连辅助提取，空^嶂，m剧tJ$ 1前售 dismutase，SOD)是需氧生物中以超氧阴离子为底物的一种酶， 超氧化物歧化酶(superoxide 统的制备、分析方法，并对其种类、化学组成、组织特异性及药理与临床应用进行了大量研究．SOD 不仅与生物体内的抗氧化、解毒作用有关，而且也与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病有关，因而 受到医药界的极大关注。 天然牛、猪血SOD是一种每分子酶含两分子铜和两分子锌的金属酶，zn“在维持酶的三维结 构方面起重要作用．而Cu2+则是酶的活性中心。二者含量的多少对酶的热稳定性有直接影响。另 外DH值也是影响SOD活性和热稳定性的重要因素，酸性较强或碱性较强都能导致酶的构象发生 不可逆转变，从而使酶失活．原因是SOD中的z矿在酸性或碱性条件下极易脱落口l。从血红细 胞中提取SOD的第一步是采用水溶胀法将红细胞胀裂，通常称之为“溶血”，然后再采用各种层 析方法分离纯化SOD[31，也有人尝试将热变性与离子交换和凝胶过滤结合起来应用【‘1。微波加热 破壁实际上是将溶血和热变性结合起来操作，在破碎红细胞膜的同时借助热变性除去许多杂蛋白， 起到一定的纯化作用，为SOD的快速、高效提取开辟了一条新途径。 2 实验材料和方法 2．1实验材料 新鲜猪血采自大连屠宰场，邻苯三酚等其它试剂均为分析纯 CR21高速冷冻离心机．日本日立公司；75I-GW型分光光度计t上海 万家乐微波炉：Hhnac 分析仪器厂：XSP．18B型显微镜．江南光仪厂：电子天平。 2．2实验方法 收集血红细胞。将收集的血红细胞用生理盐水洗涤三次。 微波提取：取适量洗净的红细胞置于烧杯中，微波一定时间破碎细胞后，加入等体积的去离 仿(乙醇和氯仿要事先预冷至4℃以下)，搅拌均匀，静置20rain，收集上清液，得SOD提取液。 水溶胀提取：在洗净的红细胞中加入等体积的去离子水，在0-4．12下．搅拌溶血30mln，再按 上面的条件缓慢加入95％的7．醇和氰仿搅拌均匀，静置20rain-收集上清液，得SOD提取液· ·辽宁省自然科学基金和大连理工大学中青年骨干教师资助项目 2．3检测方法 SOD活力测定采用微量邻苯三酚自氧化法嘲．在25℃下，抑制50％邻苯三酚自氧化的酶量定 red cell)表示； 义为一个活力单位；SOD的提取率以每毫升红细胞中提出的SOD活性单位(U／ml 比活即每毫克蛋白质中SOD的活性单位(U／mg 以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白． 385 3 实验结果和讨论 3．1微波时间的影响 量取10ml干净的血红细胞5份于80ml烧杯中。其中一份用水溶胀提取，另外四份分别用微 收率和比活比值是微波处理的提取率和比活与水溶胀法的比较值。从图中可以看出，SOD的收率 随微波时间的延长基本呈下降趋势，而比活在初始阶段随微波时间的变化不大．i5s后则迅速增 加。这是由于微波时间增长，一方面会增大细胞的破碎程度而提高提取率，显微镜观察表明．微 波处理lO秒钟后所有红细胞都已破碎：另一方面会导致部分酶蛋白随温度的升高而失活，所以收 率在总体上随微波时间的延长而降低，但在中间阶段叉稍有波动。由于大多数蛋白质都能耐受一 定的温度，所以对比活而言，在15 s之前变化不是很大；微波时间增至20 s．胞内液体开始沸腾． 许