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用cDNA
多药耐药相关新基因①
谭趣红赵春华诱纯正o
(中国医学科学硫、中国协和医科大学血液学研究所
实验血液学国家重点实验室天津300020)
多药耐药性(multidnJgr商s协nce，MDR)的产生是化疗失败的主要原因之一。为了
研究MDR产生的机制，用阿霉素(ADM)对K562细胞进行了长期诱导，经筛选获得了一
Al*c基本无耐药性。我们在分析K562／A02的耐药机制时发现mdrlmRNA明显升高，
基因，了解多药耐药可能的新的分子机制，选用含有1176个基因的cDNAMi∞)amy对
K562昭．02和K562细胞mRNA的表达进行了对照分析。
1材料与方法
1．1试剂与材料
At■“H1mancDNA
E】【pre商0nMi∞)amy是aont。ch公司产品，选用古有1176
N尼龙膜、Pribe
QLlaIlt ci／hⅡ∞l；
Random
Prinler标记试剂盒(Stratag朗e)；x线片(K0da】‘)。
1．2细胞培养
细胞悬浮于RPMI1640培养液中，加10％胎牛血清(医科院血研所)、10Ir州几
Hep∞和1％谷氨酰胺，37℃、5％e。2、饱和湿度的培养箱中培养。K562／A02细胞在培
养过程中加阿霉素1蟮／“，以维持耐药性，使用前3天撤药。
1．3国NA探针的制备
0国家九五攻关课题(96．906_01_23)和国家自然科学基金资助项目(鲫870860)
o通讯作者：T乩022一”2307加．Fh：022B眦d：四碰垡丛适±匹：Ⅱ：塑
401·
cDNA
取试剂盒说明提取总RNA，再按照AtIas
ExpressbnMicroarrauserManual进行
操作(Pr3140—1)，即：总RNA经DNase
I处理以除去DNA污染。取总RNA4旭与10×
∞s引物混合液1
m混匀，再以去离子水将体积朴至3pl，70℃放置2IIlin，然后50℃
2 Bdfer Mix
rnin．加人反应体系中。反应体系包括：5×Reaction
2正，10×dNTP1脚，
3．5
[*2P]蝴P
p1，D，兀、(100rnI州几)0．5山，M．~ⅡⅣ逆转录酶(50u／；d)lpl。小心混
匀，50℃放置25 m0】／LED]rA[pH8．O]；1
min后加入10×中止液l叫(O．1 mg／瑚gl，∞．
SPIN一200
gen)。用a皿的MA DEPoH20∞1urnn纯化探针。
1．4出NA探针与Atl“MicrQarray杂交
用去离子水湿润Mic㈣y，置于杂交瓶中，并向其中加入lOrnl预热至68℃的
Tnin，并不断振荡。
Exp∞卜b南杂交液(内古100帽刖热变性的鲑鱼精DNA)，预杂交30
DNA
加删n，再加人1 5
pg／柚C0t_l
孵育10耐n。除去Micr_)蚰y杂交瓶中的预杂交液，向其中加入cDNA探针和含有
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