Ce离子对寡聚脱氧核苷酸的水解断裂作用地研究.pdfVIP

Ce离子对寡聚脱氧核苷酸的水解断裂作用的研究 夏静芬 沈鹤柏 吴庆锋 章宗穰 上海师范大学生命与环境科学学院．上海，200234 核酸的切断与基因重组技术是分子生物学和基因丁程的核心技术，其中对DNA、RNA的定点切断 又是该技术的关键。近年来t稀士离子及其配合物作为切断DNA磷酸二酯键的分子剪刀的研究逐渐受 GGAGGCGAACOATACGCATCGAC1’GT3’)的断裂作用，井系统研究了不同价态铈离子及各种条件 对切断反应的影响．提出了切断机理。 kt 取0．33 I．t g／u DNA5 l的人工设计的26bpOligo 1加入等体积的用Tris—Hcl缓冲液配制的 用银染法显示电泳结果。 DNA的水解断裂作刚的屯泳谱图。 图l为不同价态的铈离子对01igo a b c d ■■ 0N^的变性聚内烯酰陂凝脞I乜泳【圣l 例l小同价态的铈离子水解切断0ligo DNA b、氮气氟I韦J下Ce(II【)对0】igoDNA的作用 a、01igo DNA的作用 C、托气氛m下Ce(1id对0ligoDNA的作用d、Ce(Ⅳ)对Oligo 3，T=40。℃．反应时间为24h ice(1id‘n二：ce(Ⅳ)]。-i0。．PH=7 DNA DNA的屯泳谱带。b则是在氮气氛围下Ce(III)离子对0【igo a为未反应的26bp的单链Oligo 的作用以后的电泳谱带．与a相比，此条谱带几乎没有什么变化，说明ce(III)离子在氯气氛帛中对叭igo DNA的作刖以后的电泳谱带，与a，b Ce(III)离子对Oligo DNA几乎没有切断作阁。C是在氧气氛罔F 相比，在26bp的叭igo DNA的作朋-可以看到d 明在氧气氛中ce(III)对01igoDNA有一定的切断作用。d是ce(Ⅳ)对01igo DNA的谱带宽度比a闰明显窄的多．此谱带F面Ⅲ0根清楚地显示出切断以后碱基数较 中26bp的01igo DNA有明显的切断作用。另外还可以从图中看出，ce(Ⅳ)离 少的DNA碎片的谱带，即ce(Ⅳ)对Oligo 子与0l DNA作州后，在电泳图上可以看到许多的碱基数较少的DNA谱带，说明此切断反应是随机的。 igo D．qA有切 断作用，在近中性的条件F切断效率比酸性条件F的好，但若继续升高PH值，到PH28左右时，切断效 率反而降低。 另外我们还研究了浓度、温度及时间对切断反麻的影响。随着浓度的增人、反应温度的升高以及反 麻时间的延K=，切断作川越采越明显。 381 DNA磷酸酯键中氧的负电荷，弗与带负电的两个氧结合，消弱了P--O键，从而使之断裂。 进攻Oligo 的另一个水分子的酸性催化作用加速。对于ce(III)在氮气氛围下没有观察到对01igo