栝蒌毛状根蛋白质分泌特性地研究——培养环境条件的影响.pdfVIP

栝蒌毛状根蛋白质分泌特性的研究 ——培养环境条件的影响 郛志刚 刁劲羽 (清华大学化工系 北京100084) 摘要括萎的毛状根内舍有耘酸抑劓蛋白等藉用价值很高的多肤类药物，通过改变其培养 环境可以促进其蛋白质的夯泌，实现有用产物的连续生产．研究发现，提高摇瓶机转速王然有 利于栝萎毛状根的生长，但不利于其蛋白质分泌；高温或低温条件虽然影响栝萎毛状根的生长。 但有利于其蛋白质分泌：提高光豫强度有利于栝姜毛状根的蛋白质分泌，但不利于其生长；提 高培养液的pH值不但有利于栝萎毛状根生长，也有利于其蛋白质分泌． 关健词分泌括萎毛状帆 。 在植物细胞或器官的连续培养挝程中，生物量的积累虽然决定了有用代谢产物的产量，但是， 由于很多代谢产物在细胞内存在反愤抑制作用，当箕在细胞内积累到一定程度以后就会停止继续 合成，其代谢途径也将中断，并改变其合成方向“’．因此，影响了有用代谢产物的积累。在植物 细胞或器官的连续培养过程中，如果促使细胞或疆官内的有用代谢产物不断地分泌到培养液中， 不但可以解除产物抑制．同时还可以利用分离与耦台技术实现代谢产物的连续生产。特别在毛状 根培养周期较长的情况下．如果只从生物体中提取有用产物，就要不断破坏毛状根，因此很难实 现有用产物的连续生产。在工业化生产过程中非常重视自动化生产控制，因此，在植物有用代谢 物质产业化生产中，促进其代谢产物分泌实现连续生产是非常重要的研究课题之一。 在植物细胞培养工程领域，由{二细胞培养的生物量积累非常缓慢，很多研究者开始通过基因 工程技术，利用微生物转化诱导植切形成毛状根”…。与正常根系一样毛状根也是已经分化的植 物器官，其产物分泌必须通过皮层戡表皮细胞，不但运输距离较长，而且由于其比袭面积较小， 正常分泌量非常有限。在很多研究报告中”“，虽然都得到了毛状根分泌代谢产物的结果，但是 其分泌机理和影响因素都不明确。{如果改变毛状根培养过程中的物理条件、化学条件和生物条 件，增大细胞膜透性，促进有用物葳通过细胞膜的分泌活动，从培养液中提取有用物质，就能够 消除毛状根内的产物抑制，实现代谢产物的分离与耦合，从而大幅度降低生产成本。 本研究采用生长速度快、遗传特性稳定的栝菱毛状根做为实验材料．首先研究了培养环境对 栝萎毛状根的生长和蛋白质分泌特牲的影响． 1材料与方法 1．1毛状根的培养实验 用无添加植物激素的船液体培养基为基本培其基，添加296蔗糖，经高温(1200／0．1mPa) 灭菌后，将栝萎毛状根切取3～4cm的先端部，接种在装有lOOml培养液的三角瓶中，毛状根 的接种量为0．29左右，每个培养周期为15d。 各种培养条件实验设计如下： 摇瓶机转速分别设定为60r／min、90r／min和120r／min； ～—r———～一 温度实验设置了20℃、25℃和30℃3个处理： 光照实验设计了暗培养、弱光培养(平均光强为3501ux，照光时间9h)和强化光照培养(平 均光强为1i00lux．照光时间15h)： 培养基的pH值分别设定为3．5、575n8．03种处理。 1．2生物量测定 在接种前测定接种量(毛状根鲜重)，然后定期取出毛状根，用滤纸吸去毛状根所吸附的培 养液，再称取其鲜重。计算毛状根的比生长速率。 1．3分泌蛋白质检测 采用考马斯亮蓝法检测培养液中的蛋白质浓度，测量培养后培养液的体积，以其乘积作为毛 状根蛋白质分泌总量。并且用聚丙稀酰胺电泳测定分泌蛋白质的分子量。 2结果与讨论 ， 2．1摇瓶机转速的影响 ， 改变摇瓶机转速主要是改变了培养器内的通气状况和增加培养液的剪切力。摇瓶机转速越 高，培养液内的溶解氧也就越多。同时，由于培养液相对于毛状根的流速加快，产生的剪切力对 毛状根的生长和分泌也有一定的影响。本研究设定培养液的pH为5．7，培养温度为25C，在黑暗 培养条件下培养15d。实验结果表明(表1)，当捧瓶机转速提高以后，毛状根的生长速度加快。 当摇瓶机转速为120r／min时，毛状粮比生长速率比90r／Ⅲin处理提高了15％。这证实了提高溶氧浓 度确实有益于毛状根的生长。但是，毛状根