EGFR突变检测的方法学探讨.pdfVIP

40．EGFR突变检测的方法学探讨 朱冠山 阿斯利康中国创新研究中心 一、为什么要检测EGI=R突变? 系列研究表明，非小细胞肺癌中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变状态与小分子靶向药物酪 氨酸激酶抑制剂(TKI)的疗效密切相关。携带有EGFR基因酪氨酸激酶区突变的非小细胞肺癌倾向 一步表明，用吉非替尼一线治疗，带有EGFR酪氨酸激酶区突变的肺腺癌病人无疾病进展生存时间显 著长于化疗，而EGFR野生型的肺腺癌病人无疾病进展生存时间显著短于化疗【3】。因此，肿瘤中EG． FR基因突变状态是预测TKI疗效的重要指标。 二、EGFR基因酪氨酸激酶编码区突变的类型及意义 随着对EGFR突变研究的重视及数据报告的不断增加，业以发现EGFR基因酪氨酸激酶区突变的 类型有数十种之多，与TKI疗效相关的突变集中于外显子18，19，20，及2l【4J。其中，带有外显子 以上H 析发现，不同的突变类型代表着对TKI治疗的敏感性的不同，大致可分为三组：①敏感突变，包括 治病人中检出率很低，但在继发性TKI耐药病人肿瘤组织中检出率达到50％之多，成为目前认为TKI 继发耐药的主要机理之一”。J。 三、EGFR突变检测流程 突变分析结果报告。其中的每一个步骤都对EGFR突变检测成功与否及数据质量起到至关重要的 作用。如果说建立合适的方法及技术平台是检测的基础，那么标本的质量控制是决定检测成败的 关键。 (一)标本采集及病理学评估 肿瘤组织有两个与EGFR突变检测效果密切相关的特点：①遗传异质性。即同一肿瘤标本中的不 同肿瘤细胞中的遗传学改变(包括EGFR突变状态)可能不同；②正常细胞混杂。即肿瘤组织并不 是纯的肿瘤细胞群体，而是有许多非肿瘤细胞如淋巴细胞及正常组织细胞的细胞混合体。因为目前可 以应用的突变检测技术尚不能做到无限敏感，因此，这两个因素成为影响有效突变检出率的重要因 素。虽然我们无法对每一例肿瘤标本的遗传异质性进行评估，但对于肿瘤细胞在拟分析标本中所占细 胞比例是可以通过病理学检查评判及优化的。 根据标本取得的方式，可将标本类型分为外科手术标本及小活检测诊断标本(支气管镜下活检 或CT引导下经皮穿刺活检)。再根据标本处理方式，可将标本类型分为新鲜／冰冻组织及福尔马林固 l 88 定石蜡包埋(FFPE)组织。前一类型的不同影响的是可供分析用的肿瘤组织量，而后类型的不同影 响的是所提取并用于突变检测的DNA质量。总的说来，外科手术取得的标本肿瘤组织量多，肿瘤细 胞含量高，而小活检取得的肿瘤组织少，肿瘤细胞所占比例低；从新鲜／冰冻组织提取的DNA质量 高，而从FFPE组织提取的DNA质量低，DNA高度片段化。 在对肿瘤组织标本对行病理评估时，观察的重点在于：①非小细胞性肺癌诊断及类型，②肿瘤细 胞比例：测序法，至少30％肿瘤细胞；ARMS法，至少2％的肿瘤细胞(不考虑遗传异质性)，③肿 瘤细胞总数：一般至少需100个肿瘤细胞以上才够突变检测分析，④对于肿瘤细胞所点比例偏低的标 本，需标识肿瘤丰富的区域以帮助富集用于提取DNA的肿瘤细胞。 (二)DNA提取及质量控制 对于从肿瘤标本中提取DNA，重点需要关注的是两件事情：①DNA得率；②DNA纯度，包括有 公认的高质量商用试剂盒进行DNA提取，特别是当需要从FFPE组织中提取DNA时。如常用的 DNAMini QIAamp Kit或其他同类产品。 为确保后续突变检测实验成功，对DNA进行质量检测是必要的步骤，特别是对于尚处于开展突 变检测初期，对整个流程尚缺乏足够经验的实验室。对于新鲜／冰冻组织提取的DNA，常用的紫外分 计法测定出的量不能代表实验能被PCR扩增的模板量。qPCR方法鉴定的另一重要目的是检查DNA 中有无PCR抑制剂。 (三)EGFR突变检测技术简介 被应用于肿瘤EGFR突变检测且各自取得一定的成功。其中包括DNA Sanger测序法[1．2】，焦磷酸测序 法o8I，PCR／SURVEYOR‘9l，dHPLC／HRMA【lo．1¨，ARMS[12’1”，PNA．LNAClamp[14)，等等。到目前为 止，应用最广的当属Sanger测序法，但从长远看，因测序法对标本质量要求高，检测步骤多时程长 (增加交叉污染导致的假阳性风险)，对技术经验要