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自噬相关基因5抑制炎症减轻心肌纤维化的实验研究 硕士研究生：赵伟导师：杜杰首都医科大学附属北京安贞医院 【摘要】 背景高血压可诱导多种心血管疾病，可使心脏靶器官受损，最终导致心力 衰竭。大量的证据表明，肾素一血管紧张素一醛固酮系统(RAAs)激活可引起心肌细胞肥大和 心脏间质纤维化，造成心脏损伤。然而，压力超负荷引起的心脏损伤的具体机制尚未完全阐 明。 炎症是高血压导致器官损伤的一个关键过程。巨噬细胞是炎症反应重要的细胞，参与心 脏炎症性损伤和纤维化。多种刺激可导致循环中的单核细胞穿过血管壁，浸润到心脏受损伤 部位，继而分化为巨噬细胞。巨噬细胞活化后可产生炎症细胞因子，包括肿瘤坏死因子一a， l和其它炎性介质。这些细胞因子参与了肌成纤维细胞的 自细胞介素一1p及转化生长因子p 活化。 自噬是近年来发现的维持细胞分化、存活和稳态的重要的溶酶体降解过程。适度自噬可 维持心血管稳态，然而自噬不足或自噬过度则可促发心血管疾病或加重病变。然而，目前还 不清楚在高血压导致的纤维化损伤中，自噬的作用及机制。我们前期研究发现，组织蛋白酶 S缺失后，自噬泡不能与溶酶体结合，导致自噬过程障碍，加重高血压造成的心脏损伤。自 噬相关基因5(At95)是自噬溶酶体降解途径中重要调节基因。心脏特异缺乏At95，可导致 心脏肥大，左心室扩张和收缩功能障碍。At95及自噬在血管紧张素II诱导的心脏炎症及纤维 化的中的关键作用及机制也有待研究。 我们假设：血管紧张II通过刺激巨噬细胞At95的表达，调节巨噬细胞线粒体自噬，对巨 噬细胞的代谢和功能起保护作用。At95基因的下调将导致巨噬细胞线粒体自噬过程的障碍， 不能及时清除Ros，ROS累积增加，可激活NF—KB，触发心脏炎症反应，加重心脏损伤。本研 究以At95杂合小鼠作为研究对象(纯合子出生致死)，关注于高血压性心脏炎症反应的早期 阶段，探讨线粒体自噬障碍导致炎症这一核心环节，为探明高血压导致心脏损伤的发病机理 提供实验和理论依据，为艋床上心力衰竭的早期干预和治疗提供新的靶点。 目的 复制血管紧张素II灌注小鼠高血压模型，采用病理学及分子生物学等技术检测心 脏组织At西的表达及炎症细胞浸润，炎症因子表达；检测巨噬细胞自噬水平，巨噬细胞RoS 产生及NF—K B的激活；观察心脏组织中胶原沉积及成纤维细胞的分化，明确At95对血管紧张 素II导致心脏损伤的调控作用。本研究旨在探讨At95对巨噬细胞线粒体自噬功能的影响及相 关信号途径的调控，为寻找有效的临床干预措施提供理论和实验依据。 方法1．研究对象分组： 机分为2组(n=8)：醋酸生理盐水溶液灌注组(Vehicle，对照组)；血管紧张素II灌注组 (AngII，处理组)。 2．小鼠高血压模型制备：采用微量泵进行血管紧张素II灌注复制小鼠高血压模型，灌 注走基率1500ng／kg术min。 F和e·Cor岖nenll州离m毒铀n毒lC矗惭掣’c毒onCa州两a5culafDisea5e 毫nd UnⅣers时 3∞Ye暂AnniVe蹲a释№椭擘af8e莓旧向啦艳^Hospital蜊自la剐locaPb{Med；caI 一6：{1一 4．心脏功能测定：采用小动物超声心动仪测定小鼠心脏功能。 5．心脏组织At95的表达：采用免疫组织化学染色方法和RT—PcR法检测心脏组织At95的表 达。 6．细胞中At95的表达：采用RT—PcR法检测心肌细胞，成纤维细胞，巨噬细胞中At95的 表达。 7．心脏组织炎症细胞因子表达：采用HE染色法检测心脏组织中炎症细胞的聚集情况。 免疫组织化学染色方法检测Mac一2的蛋白表达；RT—PcR方法检测炎症因子IL一1B、TNF—a的 mRNA表达。 8．心脏组织自噬的检测：采用免疫荧光共定位法及RT—PcR方法检测心脏组织中Lc3的表 达。 9． 巨噬细胞自噬的检测：采用免疫荧光共定位法激光共聚焦显微镜观察F4／80与Lc3 共定位，MitoTraker与LC3共定位。western B10t蛋白免疫印记法检测巨噬细胞Lc3II／I农 达及定量。透射电镜观察巨噬