稳定同位素探针在水稻土产甲烷古菌研究中应用.pdfVIP

稳定同位素探针在水稻土产甲烷古菌研究中的应用 陆雅海 (中国农业大学资源与环境学院 北京 100094 环境微生物包括生长在土壤、水体和沉积物等生境的微生物群落，种类极其丰富多样。 环境微生物的多样性和生理生态功能过去通常是用实验室分离和培养等技术加以研究。近20 年来，分子微生物生态技术迅速发展，通过对环境16SrRNA基因进行的大量研究表明环境微 生物多样性远高于以前传统方法的估计(Amann等1995)，一克土壤可含约2000至18000个基因 组的原核微生物 ((Torsvik等2002)。这些研究清楚表明环境中绝大部分微生物实际上从没 有得到过分离研究，这些未培养的微生物与已培养的种群在系统发育上往往存在很大差距 (Pace,1997)。目前，对这些微生物在环境中的功能了解甚少。所以，大部分环境生物化 学过程的微生物学机理目前很不清楚。深入理解环境微生物生物多样性、生理生化过程及机 理是面对环境微生物工作者的重大挑战。近年来分子生态方法正在取得一系列新的进展，用 这些新的方法将使探索环境微生物不同种群的生态功能成为可能。 这些进展的一个重要方面是环境基因组学。Hurek等 (2002)提出测定环境微生物新陈 代谢中的关键基因能提供微生物群体的功能信息。例如固氮基因特别适合于进行固氮微生物 的系统发育分析。建立功能基因文库可揭示根际微生物的功能多样性omRNA实时定量分析则 可预测功能基因的表达水平,Martin等 (2001)认为功能基因组学正在使生物机理研究得到 革命性进展。功能基因组学是分析有机体的所有遗传物质，并将遗传信息与有机体的形态和 功能联系起来。通过以基因组学为基础，在不同水平上分析转刻组学、蛋白组学和代谢组学， 有可能使环境生物共生关系的机理研究取得突破性进展。但环境基因组学必须要面对环境微 生物之间相互作用的复杂性、面对环境微生物及其共生体随生物、物理、化学等环境条件而 变化的复杂性。目前，DNA芯片技术已在植物和基础微生物学得到广泛应用，但在环境微生 物生态领域的应用尚属起步阶段。Sanguin等用16SrRNA基因芯片技术观测玉米根际的细菌 群体结构(2004年德国慕尼黑国际根际大会资料)。他们设计了包含200个正核普酸探针(片 段长为20碱基)的DNA芯片，测试了玉米根际和根外土壤的微生物群体，发现根际工〕NA的杂交 水平明显高于根外土壤。Shinano等亦报道了用于探测根际微生物群体的DNA芯片研制工作 (2004年德国慕尼黑国际根际大会资料)。这些研究表明用DNA芯片技术有可能对土壤微生 物群体结构和功能进行快速高通量分析。但是技术本身尚有许多制约因素需要克服和完善。 在探索土壤微生物功能的研究中，另一个新的方法是将稳定同位素标记技术与分子生态 技术相结合的手段。用于同位素标记的生物分子包括来自于微生物细胞膜的磷脂脂肪酸和细 胞核酸分子。Boschker等 (1998)首次将磷脂脂肪酸一稳定同位素探针技术 (PLFA-S工P) 应用于海洋沉积物的甲烷氧化细菌研究。他们用C-13标记的甲烷与沉积物培养，发现16:18 磷脂脂肪酸显著被C-13标记了，表明TypeI甲烷氧化细菌是海洋沉积物的主要甲烷氧化者。 Bull等(2000)用相似方法研究发现土壤的甲烷氧化细菌多样性高于海洋沉积物，不但Type 工和TypeII甲烷氧化细菌十分活跃，而且可能以磷脂脂肪酸6r17:1为标志分子的新甲烷 氧化细菌也起重要作用。尽管磷脂脂肪酸可用于微生物群落结构的定量分析，但磷脂脂肪酸 对微生物种群的分辨率很低，PLFA-SIP只适合于一些特定微生物种群如甲烷氧化细菌、乙 酸氧化细菌等的功能研究。为改进稳定同位素探针技术的灵敏度。Radajewski等 (2000) 发明了以DNA为目标分子的稳定性同位素探针技术 (DNA-SIP)，他们将这个技术首次应用 于在土壤甲烷和甲醇氧化细菌的研究。这个技术的要点是首先向受试环境供应13C标记底物， 然后从环境样品中提取核酸，用超高速离心技术将核酸分成重核酸(’3C标记)和轻核酸 (非 170标记)两个组分，用分子生态技术对130标记和非标记的核酸进行指纹分析，用系统发育 分析方法确定 活‘跃’微生物种群。此技术可避免实验室培养而直接原位鉴定和探测微生物 的功能，为原位联结微生物种群和功能提供了强有力手段，特别适合于环境微生物过程的研 究。Jeon等(2003)将此技术应用于沉积物多环芳烃降解细菌的原位研究，发现Polarmon