下班化冻存大鼠胚胎神经细胞和脊髓移植的研究.pdfVIP

玻璃化冻存大鼠胚胎神经细胞及脊髓移植的研究 ～～。～一—一～——～～—，一 杭州大学生命科学学院杭州大学实验中心(310012) 胡军祥 成杰群 昊丽萍 曾跃武 冯春木郑斯涌 1．引言 j 近年来，随着胎脑移植手术的动物实验 冷冻至一7s℃，再以3℃／rain降麓一蛄℃。f 和临床治疗的广泛开展，观察到胎脑移植治 投人液氮(一196℃)冻存。 f』 疗帕金森氏病、小脑萎缩‘、侏儒症、垂体机能 2．2．2玻璃化冻存组冻布液为台有f J 减退及脊髓外伤性截瘫等多种神经系统疾病 具有较好的疗效。而通过深低温冻存的胚胎 0％W／V丙二醇、4．1％w／vJ聚乙=醇f 神经细胞，其免疫排斥性有所降低，并使供体 和受体之间在移植时间上得到匹配，有利于 Fahy方法分三步进行预平衡，蜊后分装人耐J 该项工作的实际应用，但胚胎神经细胞体外 低温塑料冷冻管内，每管0．5mlJ样品直接捌 生存条件要求高，易受冻一融过程的损伤，比 人液氮保存。 其它细胞较难冷冻保存，有关报导尚不多见。 2．2．3复温与冻存液洗脱l玻璃化辅 本文对大鼠胚胎神经细胞进行玻璃化冻存， 慢速冻存的大鼠胚胎神经细胞样品，在冻存 检测在深低温状态下神经细胞的活力及功能 后1、lO、20和40天，38℃水浴快速复温，用 变化，并与常规慢速降温法比较，分析影响神 经细胞活力的因素及作用机理，以评价冻存 稀释，经离心洗脱冻存液，神经；l田胞重新悬弹 细胞的质量。 于1640渡中． J。 2．材料与方法 2．3检测指标 f． 2．1 2．3．1胚胎神经细胞存活率台盼涟 孕13—20天Spraque--Dawley大 鼠，由浙江省实验动物中心提供。在无菌条件 拒染法检测神经细胞存活率。f J 下取出胎鼠的大脑皮层部分，用RPMll6402，3．2胚胎神经细胞涵力分析戈鼠 液(Sigma产品)漂洗三次，尽量去除胎膜、血胚胎神经细胞悬浮液加入FDA／EB双到酸 管及红细胞。分散胎脑组织后，再用4号针头 荧光索／溴化乙键)染液，含痂gFDA和，0． 过滤，制得的胚胎神经细胞悬浮置于台 20IU／m!肝素的1640液内。词节细胞数至2徽镜观察(落射荧光，阻断滤培为Yw+率，B ×10’个／m!。 为激发滤片)。活细胞呈绿色荧光，死细胞呈 2．2实验分组 红色荧光．观察并计算活细触酉分率。 2．2．1慢速冻存组冻存液为含有 2．3．3胚胎择经细胞臃完整性测定 加入FDA的太鼠胚胎神矧细胞悬浮浪，经 20％DMSO(二甲基亚砜)和40％小牛血清 的PRMIl640液。与大鼠胚胎神经细胞悬浮离心和重蒸水破碎，制得删上清液用岛津 液等量混合，使DMSO的终浓度为lO％， ·120· 度，激发波长为244．Snm，发射波长为358．只，体重158士14e，胸1l一13全椎板切除， 2nm。 暴露脊髓，以胸12为中心做右半脊髓区块切 2．3．4胚胎神经细胞培养采用10ml除。层厚2mm。将大鼠分成(1)移植玻璃化冻 液体培养法，胚胎神经细胞悬浮液2ml，小牛 存组：10只，用玻璃化冻存40天的神经细胞 血清1．5m1，DMEM(Dulbecco’sModified悬浮液，经离