rhGM-CSF%2fIL-3融合蛋白的细菌内毒素测定和其干扰因子的研究.pdfVIP

』廷鲤选二e靼／珥．1．雎合爱白的细盖塑曼塞裂枣 及其王撞固子的研究 陈敏邱雪莲 (汕头515041 华茵生物工程公司生物技术研究所) 分子，由本所进行中试生产．中试头3批产品获得中国药品生物制品检定所的检验合格证书．在G3 的生产过程中，经常出现内毒素与热源(寡兔)检查结果不一致的现象．据文献报道，凝血一。透析 膜，葡聚糖等等对鲎试剂有影响，但是特异性鳖试剂不受葡聚糖的影响，而凝血酶，透析虞．Tris等 G3生产过程中使用的试剂和材料对特异性鲎试剂的影响程度还未见报道．本文就G3的内毒素检 查对比了两种鲎试剂(特异性鲎试剂和警通鲎试剂)的差异，并比较了几个干扰因子影响．结果说明 了特异性鲎试剂作为G3样品内毒素检查用试剂更为合适，并建议生产过程中存在同样干扰因子 的生物制品的内毒素检查也使用特异性鲎试剂。 l材料与方法 1．I试剂 批号962(中国药品生产物制品检定所)。鲎试剂溶解水：批号960l24(厦门鲞试剂厂)．凝血酶 4301U／ml，批号9705(中国药品生物制品检定所)。 Tris：分析纯、美国ICN公司出品。 1．2透析袋的处理 将透析袋授泡予新鲜蒸馏水中于121’C高压灭菌30rain，同时千另一瓶中装同样的薪鲜蒸馏 水，相同条件下灭菌，作对照。 I．3 G3样品 由本所发酵室发酵表达，蛋白室纯化，制剂室冻干而成。 I．4细菌内毒素检查方法． 2结果 2．1细菌内毒素限值及最大稀释浓度的确定 大剂量15EU／kgt计算得G3的细菌内毒素限值为0．33EU／kg，G3I葶品强度为150／-tg／ml，列最大 度／MVC=150／I．5；100． 2．2 G3增强抑制实验 取G3成品3批，分别用鲎试剂溶解水以1：100稀释，再取细菌内毒素国家标准品用鲎试剂溶 检查法中鲎试剂灵敏度复棱法进行普通鲎试剂和特异性鲎试剂的灵敏度试验，同时设嬲性试剂．结 124 果见表1． 寰1 G3ill曩押■试■垴暴 样品批号 内毒素椎生(EU，m1) “·“为特异性鳖试剂的检查结果 2．3干扰因子的检查 2．3．1凝血酶的增强抑制实验；取凝血酶一支，用鲎试剂溶解水溶解并稀释成每lml含凝血酶 1．o．0．5，0．25，0．1 Iu的一系列浓度，取细菌内毒素国家标准品用鲎试剂溶解水溶解并稀释成每 结果见表2。 囊2攮血I的增薯抑■实验螭幂 凝血一浓度 内毒素饿疰(Iu，m1) 2．3．2透析的干扰试验：将灭菌后的透析袋，双蒸水倾出，在袋中装20ml鲎试剂溶解水t再浸泡 于20ml的鲎试剂溶解水中．室温放置。每间隔1，2．4h袋内及袋外水。参照细菌内毒素检查法用两 种鲎试剂作内毒素检查，结果见表3。 裹3透析千抚内毒囊检查的培集 2．3．3 用两种鲎试剂作内毒素检查．结果见表4． 125 囊‘Tril对内●蠢捡童的千抚寰t缩幂 3绪论 3．1由表【说明了1：100作为G3样品细菌内毒素检查的稀释倍散是合适的．对两种鲎试剂都没 有增甍抑制作用。 3．2由表2，表3．表4说明，凝血蘸，Tris和透析袋等3种干扰因子对两种鲎试剂都有影响，但是 特异性鲎性荆受干扰程度小一些，它们的反应机制则需作进一步的研费：。 3．3 由于G3使用普通鲎试荆的细菌内毒亲检查结果与热原(家兔)植查结果常出现不一致现囊， 而后来使用特异性鲎试剂的结果与热原结果则有较高的一致性，其原因可以从上面几种干扰因子 的检查结果得到说明。而消除干扰因子，应该是在样品纯化过程中尽It降低凝血酶和Tris的残余 量，样品的脱盐尽量不用透析的办法，目前pharmaeia公司已经推出脱盐柱代譬透析袭，可以试验 一下．G3样品的细菌内毒素检查使用特异性鲎试剂较为合适。 苤夔地黄丸f缺味药的墨az楚基和