巴氏毕赤酵母表达戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白免疫原性研究.pdfVIP

A20，巴氏毕赤酵母表达的戊型肝炎病毒 结构区ORF2蛋白免疫原性研究 北京军区第=六一医院(100094) 佟玉品詹美云鲁健白玉毕胜利 戊型肝炎基因工程疫苗的研制与开发一直是戊型肝炎病毒研究中的重要内容。但采用何种表达系统 作为疫苗开发工具目前尚无统～认识。原核表达系统由于不能很好保持表达产物的生物学活性，开发戊 型肝炎疫苗不太适用。杆状病毒表达产物虽然免疫原性较好，但受到昆虫蛋白异质性的限制，目前美国 FDA尚未批准应用该系统作为疫苗开发工具。哺乳动物细胞表达量低，成本高，大量培养极为困难。痘 苗病毒在表达产量和安全性上亦存在问题。因此，有必要寻求新的表达系统研制戊型肝炎疫苗。近年 来，甲醇营养型酵母表达系统以其表达产钫类似于天然蛋白，能保持很好的生物学活性，易于规模化生 产等优势作为疫苗研制的载体已被成功应用，但国外尚未见有应用该系统表达戊型肝炎病毒(HEW)结 构区基因ORF2的报道。我们利用甲醇营养型酵母表达了编码HEWORF2第69—660氨基酸的基因，得 到分子量为59KD的重组蛋白，作为抗原应用于戊型肝炎患者及HEW感染恒河猴血清抗HEV抗体的检 测。证实该抗原具有良好的抗原性。在此基础上．应用其免疫BALB／C小鼠，通过鉴定抗血清与天然 }母v结合能力及小鼠ED50实验对其免疫原性进行进一步观察。 材料和方法 + 1．HEV ORF2重组蛋白铜备：重组蛋白为编码HEVORF2第69—660氨基酸的基因在巴氏毕赫簿母 的表达产物经纯化获得，分子量为59kD，纯度为96％。应用蛔法进行蛋白定量。最后稀释为40V唔／ ml。 B／C小鼠，雌性．8—10周龄，体重20一22克。购自中国医学科学院 2．小鼠抗血清的制备：BAL 实验动物繁育中心，由本室饲养(国家二级动物实验室)。重组蛋白5099加等体积福氏完全佐趣(各 o．25仃d)腹腔注射免疫小鼠，于第3周加强一次，第6周应用抗原联台福氏不完全佐剂加强一次，第7 周采血，分离血清，一2|0℃冻存备用。小鼠免疫前血清作为阴性对照血清。 3．HEV感染恒河猴胆汁及粪便采集：参见文献，建立恒河猴戊型肝炎动物模型，恒河猴．5鳆，由 广西壮族自治区卫生防疫站提供并饲养，雌3雄2，体重1．5—4．D千克，猴龄2—3岁，单笼饲养。实 验前采血，分离血清，检测各种肝炎指标阴性后以静脉注射方式用HEW病毒攻击，哪Ⅳ病毒为中国新 疆一急性戊型肝炎患者粪便感染恒河猴发病后所采胆汁．经liT—PcR检溯阳性。每只恒河猴注射含 0．05克氨苄青霉素处理的胆汁lml。恒河猴自攻毒后第2周起收集粪便。一20℃冻存备用。采用常规方 备用。 3，。引物根据HEW新疆分离株ORF2基因序列设计，由：115京赛百盛生物技术公司合成。主要步骤与实验 PcR管，37℃温育 条件有：①包被以浓度tt,e／．a的抗小鼠斡抗体(si畔公司产品)100m包被0．5ml 以正常猴粪便和胆汁作阴性对照，室温结合lh，4℃过夜；④eDNA合成在上述PCR管中加入反向引物 2．5mM的dNTP，5 RTP2100pmol，8m 5min后立即冰浴，加入5u x 中取5pl应用RTfE和RTPl再次PeR扩增，PeR反应体系为loofa，含10 dNTPs 8皿，1000∞1引物各1一，Taq 94ac 60s，48qc 泳观察结果。 5．免疫材料及方案 5．1实验动物：BAL 动物繁育中心。由本室饲养(国家二级动物实验室)。 5．2免疫佐剂：氢氧化铝佐；弼为北京华尔顿科技服务公司制品，批号为1999—10—20，浓度为 1826)，全链硫代修饰．由上海生工 2酬。cpc序列：5’一TCCATGACGTICCIGACGTr一3’(c1)G—ODN 生物工程技术服务有限公司合成并纯化。 5．4免疫方