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弗朗西斯菌类脂A结构多样性及其调控机制研究 李颜颜 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，214122 类脂A,俗称内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞外膜外侧的重要组成成分，在维持细胞外 膜完整性、通透性以及免疫系统识别等方面起着重要作用。当细菌侵入宿主后，其表层类脂 A可以被宿主免疫细胞表面的TLR4受体识别，随之引发胞内的信号通路，生产及释放IL-8 和TNF-α等与防御相关的细胞因子。 组芯片、基因高效表达、蛋白纯化和酶学性质分析、基因敲除突变株构建和细菌致病毒力研 究等方法手段，发现了与类脂A结构多样性相关的基因，深入研究了相关的分子机制。主要 研究内容如下： (1)利用高分辨率多级质谱鉴定了弗朗西斯菌类脂A的结构多样性，发现了类脂A分 子结构受温度变化影响的规律。 体外模拟弗朗西斯菌生存环境的温度变化，在三种不同温度(180C，25。C和37。C)下 MS一级 培养弗朗西斯菌，提取类脂A，利用高分辨率质谱进行结构分析和鉴定。MALDI—TOF 质谱结果表明：弗朗西斯菌在不同温度下可以合成不同结构的类脂A(180C—m／z1609，25。C —m／z1637，370C—m／z1665)；随着温度的降低，弗朗西斯菌合成类脂A的脂肪酸链长度 变短(c。H。一m／z24)。QIT—TOFMS“多级质谱鉴定表明：类脂A的结构存在多样性，结构的 变化主要发生在^L连接的2位和2’位脂肪酸的链长上。ESI—Q—TOFLC—MS表明：在不同的 温度下，类脂A合成的中间代谢产物(LipidX)的结构也存在多样性。温度变化动态模拟 分析表明：一旦环境温度改变，弗朗西斯菌便可迅速调整类脂A分子的精细结构。 (2)鉴定了弗朗西斯菌类脂A合成途径中的关键基因lpxaPl和lpxD2,探明了二者转 录水平的差异与温度的相关性。 通过生物信息学分析，鉴定了弗朗西斯菌中存在的两个类脂A羟基脂肪酸转移酶编码 基因lpxDl和lpxD20LpxD催化类脂A合成途径的第三步反应，在革兰氏阴性细菌内相对保 守，一般只有一个，但在弗朗西斯菌体内却存在两个。LpxDl和LpxD2之间氨基酸序列同源 性为3470，各自在不同的弗朗西斯菌亚种中同源性高达9870。进化树分析发现：LpxDl与大 肠杆菌的LpxD同源性很高，而LpxD2却与很多厌氧菌的LpxD同源性高。全基因组芯片的转 录组学分析发现：lpxDl的转录在37。C上调，而lpxD2的转录在21。C上调。在大肠杆菌中 异源表达弗朗西斯菌的LpxDl或LpxD2，其类脂A的结构发生变化。野生型大肠杆菌类脂A 在2位和2’位含有短链脂肪酸3-0H-C14(m／z1796)，而表达了LpxDl或LpxD2的大肠杆 菌类脂A在2位和2’位上添加长链的脂肪酸3一OH—C16或3一OH—C18(m／z1824，1852)。THP一1 细胞实验表明：TLR4对经过LpxDl或LpxD2修饰调节后含有长链脂肪酸的类脂A的识别能 力减弱。 (3)分离纯化了LpxDl和LpxD2酶蛋白，并进行了酶学性质分析，发现了二者最适催 化温度的差异。 首先，在大肠杆菌中构建了LpxDl或LpxD2的高效表达菌株，并分离纯化了两种蛋白 个蛋白的活性受温度调控；底物特异性实验结果表明：LpxDl的最适底物为3一OH—C18，而 对两个蛋白的活性有抑制作用。 (4)构建了弗朗西斯菌脂肪酸酰基转移酶突变株△lpxOl和Alpx02,并分析了突变 株类脂A结构的变化。 通过基因同源重组方法构建了弗朗西斯菌△lpxDl和△lpxD2突变株。提取突变株在 不同温度下合成的类脂A，并用质谱进行结构鉴定分析。结果表明：两个突变株在不同温度 下合成的类脂A不再受温度的影响，A 1609， lpxDl突变株合成的类脂A的结构锁定在m／z 而AlpxD2突变株合成的类脂A的结构锁定在m／z1665。利用多级质谱对类脂A结构多样性 分析发现：两个突变株的类脂A结构多样性明显降低；AlpxPl突变株合成的类脂A在2位 和2’位上含有3一OH—C16，而AlpxP2突变株合成的类脂A在2位和2’位上含有3一OH—C18。 AlpxPl和A