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免疫抑制剂诱导外周T淋巴细胞凋亡的研究 北京解放军总医院(301医院)泌尿外科 女序仁徐衍盛赦建华 诱导免疫耐受是器官移植领域的最终理想目标。其机制涉及克隆清除(凋亡)、失能、忽视、免疫 调节或抑制等。近年的研究显示：活化T淋巴细胞的凋亡在外同耐受的诱导中起着重要的作用。但目前 器官移植临床所用的各种免疫抑制剂是否可诱导活化T淋巴细胞的凋亡，尚无定论。 本研究通过体外细胞培养的方法，探讨目前临床常用的各种免疫抑制剂对人外周血T淋巴细胞凋亡 的诱导效应。 材料与方法： 一、免疫抑制剂和主要试剂 (FKS06，香港藤泽公司)，环孢素A(CSA，北京诺华公司)。 二：、细胞分离与细胞培养 将白细胞悬液(解放军总医院输血科提供)用lXPBs稀释后， 用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术公司)分离淋巴细胞，在含10％ 这样分离的淋巴细胞中，含有65．7+／一2．O％的T淋巴细胞。 按照文献推荐的方法建立短期应答的T细胞系，即取5x106／ml新分离的外周T淋巴细胞，加入 细胞，在培养液中加入rlL一250U／ml继续培养3天，即作为短期应答T淋巴细胞。 的方法加入免疫抑制剂： 单克隆抗体。37℃、5％C02培养3天，观察凋亡的发生。 三、细胞罚亡的检测与分析 胞悬液加于洁净的载玻片之上，用共聚焦显微镜在280rim发射波长下观察。 2．流式细胞仪(FAcs)测定：按照文献的方法，将细胞用70％的酒精固定，PBS清洗后，用 颗粒的FSC和SSC。 3 1．5％琼脂糖凝胶电泳50V，两小时。凝胶成像系统观察结果。 一GAAC明c【BAGGAAAC一3’。3’引物序列为：①5 ·440· 68℃lmin。最后68℃，延伸10rain。 扩增，条件为94℃，30S；60qc，lmin；72℃lmin。最后72。C，延伸lOmin。 四、IL一2和Fas表达的检测 时相点各样品上清中出ⅡJ一2和E∞的浓度。 五、统计学分析 采用Stata7．0软件进行，实验数据均以平均数±标准差来表示，计数资料采用Y2检验、计量资料 应用t检验进行分析，以P0．05作为差异的显著性意义。 结果 一、各种免疫抑制剂对静止和活化T淋巴细胞凋亡的影响 如表1所示，静息T淋巴细胞加入各种免疫抑制剂后，除Pred略为明显地增加凋亡外，其余药物 所引起的凋亡细胞均未见显著增加。 表1 免疫抑制剂对静止和活化T淋巴细胞的凋亡的影响 免疫抑制剂 静止T细胞 活化T细胞 对照 0．14±0．06 16．25±0．66c MPA 0．17±O．06 2346±1．97b．c AzA 0．26±0．07 20．15±1．20b．O CSA 0．26±0．21 1．23士0．40b FK506 O．16±0．09 1．26土0．28b Pred O．67±O．21a 18．65士1．0Ja．o RAP O．35±019 1．37±0．45b CD25一曲 0．20±O．15 1．81±0．53b 与对照组比：a，P0．05；b，P0．01；与静止T细胞比：c，P0．01 而活化T细胞的凋亡细胞由静止期的0．14％增至16．25％，再加入各种免役抑制剂后，可见MPA、 AZA及Pred三种药物进一步诱导凋亡细胞的增加，无论与加药前的对照组或与静止T细胞比，其差异 具有显著或非常显著性的意义。同时，上述三种药物作用后的T淋巴细胞不仅AO染色共聚焦显微镜可 见到核碎裂和细胞皱缩发生，而且FAcS检测也可发现在二倍体峰(M2期细