肠出血性大肠杆菌O157∶H7胶体金检测试纸条的研制.pdfVIP

肠出血性大肠杆菌O157∶H7胶体金检测试纸条的研制 谢世琦 孟宪荣 栗绍文王 倩 潘秀华张超 张丽嫒 华中农业大学动物医学院湖北省预防兽医学重点实验室，武汉，430070 摘要：肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的食源性致病菌。本实验利用实验室制备的抗 EHECO157∶H7的单克隆抗体开展了O157∶H7胶体免疫层析检测试纸条的研究。采用柠檬酸 三钠还原法制备胶体金，标记单克隆抗体1H3后喷涂于玻璃纤维膜样品垫部位，以另一株单 克隆抗体6F4包被于硝酸纤维素膜检测线作为捕获抗体，以兔抗鼠IgG多克隆抗体包被质控 线，利用双抗夹心法制成EHECO157胶体金免疫层析检测试纸条。该试纸条与EHECO157 反应成阳性，检测敏感性为105CFU/mL，且特异性良好，显色时间在15min以内。本研究成 果为开展食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的快速筛查提供了重要材料。 关键字:肠出血性大肠杆菌；O157:H7；单克隆抗体；胶体金；免疫层析试纸条 第十二届学术研讨会 将Ecoli 取典型菌落接种于改良EC肉汤中，370C培养12h。进行菌落计数后收集菌液，沸水浴2．5h， 制备菌体抗原，用生理盐水调节至1x109CFU／mL。 1．4抗体识别表位鉴定 coli 对实验室已有的8株抗E 0157：H7的单克隆抗体进行单抗识别表位的筛选。用相 OgM) 三株单抗；用辣根过氧化物酶对6F4进行标记，包被0157抗原进行ELISA，分别加入1H1、 对6F4识别位点的影响情况。 1．5胶体金试纸条的制备 1．5．1胶体金的制各 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。取100mLddH20用磁力加热搅拌器加热至沸后加 入lmLl％HAuCl4，继续加热2min，迅速加入1．6mL1％柠檬酸三钠，待出现稳定酒红色时 继续加热15min。于室温下搅拌冷却，定容至200mL，412保存备用。 1．5．2最佳标记pH值的确定 在离心管内加lmL胶体金溶液，用0．1mol／L K2C03分别调节pn至6．5、7．0、7．5、8．0、 波长范围扫描，最大吸收峰所在的pH值即为胶体金最佳标记pH值。 1．5．3最佳抗体标记量的确定 在离心管内加入lmL胶体金溶液，用0．1mol／L K2C03调节pH至最佳标记值，再加入 1009L，静置2h后观察结 不同量的1H3单抗(0．1mg／mL)，混匀静置5min，加入10％NaCl 果，以使胶体金溶液保持红色时的单抗量为稳定胶体金的必须单抗量，在此基础上增加20％ 为最适抗体标记量。 1．5．4金标单抗制备及纯化 取10mL胶体金溶液，于磁力搅拌器上，用0．1moFL K2C03调节至所需的pI-I，加入所 物经4C12000f／min离心30rain，弃上清，加入硼酸缓冲液至原体积，重复用硼酸缓冲液洗 涤两次，最后沉淀用1／10原体积的硼酸缓冲液重悬，即为纯化好的金标单抗，4f2保存备用。 1．5．5封闭液确定 蔗糖+0．02％NAN3，用PB溶解配制不同的封闭液，对金标垫和样品垫进行封闭，组装试纸 条进行检测，对比不同封闭液对试纸条灵敏度等的影响，筛选最佳封闭液。 1．5．6胶体金试纸条的组装 金标垫和样品垫用封闭液封闭，将金标1H3单抗喷涂于金标垫上．NC膜上T线包被 第十二届学术研讨会 6F4单抗，C线包被兔抗鼠IgG多克隆抗体。组装好胶体金试纸条。 1．5．7样品稀-释液确定 使用添加0．01％Triton的0．01mol／L PBS作为样品稀释液，并将其pH值分别调节至6．0、 6．5、7．0、7．5、8．0、8．5、9．0，各取lOOld。加入试纸条中，15min后读取结果。 1．6胶体金试纸条的评价 1．6．1