β-防御素基因在毕赤酵母中分泌表达的影响因素及其优化.pdfVIP

2007中国中部地区农产品加工产学研研讨会论文集一一其他综合 B．防御素基因在毕赤酵母中分泌表达的影响因素及优化 解民1，亢春雨1，苏旭东1，樊喜福2，马小燕1，李英军1，张会彦1，张伟1 摘要：巴斯德毕赤酵母表达系统是一种优秀的重组蛋白表达系统，近年来被广泛的应用于重组蛋白的表达。 该文从诱导时间、pH值、甲醇剂量等方面对重组基因酵母工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化，找出最佳的外 加入量为每日1．0％。 关键词：巴斯德毕赤酵母，，B防御素基因，摇瓶发酵 快，培养基廉价，但所表达的外源蛋白难以进行正确 0引言 的翻译后修饰加工，且融合表达的后处理麻烦。而昆 随着抗生素的大量广泛用于饲料和人们对食品、 虫杆状病毒表达的外源蛋白虽能得到良好的翻译后 环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用认 修饰加工，但其成本较高，不适宜大规模生产。毕赤 识日益加深，抗生素在饲料业中的应用已面临着淘汰 或禁用的局面。应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗 的外源蛋白表达系统，但利用其表达抗菌小肽的研究 生素作为饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的 报道较少。我们采用AOXl为启动子的毕赤嗜甲醇酵 一项重要内容。中国已进入WTO，以抗生素作为饲 母工程菌，进行了摇瓶发酵表达防御素蛋白的培养条 料添加剂必将严重影响畜产品在国际市场的竞争力， 件优化试验。 一 所以应用生物技术研究开发新型抗菌剂成为中国饲 l材料与方法 料科学界一项紧迫的任务。 1．1材料 防御素(defensin)是生物体抵御病原体的防御 反应过程中产生的一类重要的抗菌肽类物质，它是一 1．1．1菌种 I15 类带阳离子、分子量一般小于410a的小分子多肽， 巴斯德毕赤酵母(PichiaPastoris)GS 既可亲水也可亲脂，能与细胞膜的磷脂结合，破坏细 胞膜，从而杀伤微生物。在畜牧生产领域中，动物p- cDNA，载体呈线型整合在毕赤 防御素有较好的研发价值。然而天然获取防御素的量 源基因为猪IB-defensin 酵母染色体上)，由本实验室构建。 及其有限，所以目前p-defensin防御素有化学合成法 及基因工程合成法。化学合成法可以方便的在合成过 1．1．2培养基 程中改变多肽的一级结构，但对于天然防御素分子中 的3对二硫键，化学合成法则难以保证二硫键的正确 基本培养基见INVITROGEN公司实验手册。 配对，从而影响了生物活性，而且昂贵的成本限制了 1．2方法 此方法的应用。而基因工程合成法易于大规模生产蛋 1．2．1摇瓶发酵方法 00mL 白质． 从新鲜YPD培养基上挑一单菌落到l 抗菌小肽在大肠杆菌表达系统【3l和昆虫杆状病 毒表达系绀4】中的表达已有报道，虽然大肠杆菌生长 值为撕，1 体沉淀重悬浮于BMMY中，013600值为l左右， 收稿日期s2007-06．23 28～30℃，250300 r／min培养6d，每24h补加一定量的 作者简介z解民(1979．