副猪嗜血杆菌部分hhdA基因克隆及表达载体构建.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会论文集 副猪嗜血杆菌部分hhdA基因的克隆及表达载体的构建 曾文斌，聂小伟，刘悦欣，黄冬艳，王 萍+ (江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045) 分离的副猪嗜血杆菌中扩增出与预期设计大小相符的hhdA基因特异性条带，将扩增出的DNA片段回收纯化与 的副猪嗜血杆菌hhdA基因大小为l809 bp。不合终止密码子的目的基因，插入位点、大小与读码框均正确。将 ku。 中，经1PTG诱导表达，经SDS电泳结果显示表达的融合蛋白约80 关键词：副猪嗜血杆茵；hhdA基因；克隆；原核表达 副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis，HPS)可引起 猪的格氏病，临床上以多发性浆膜炎、关节炎、脑 膜炎、肺炎为特征。该菌已成为国内外引起保育仔 猪嗜血杆菌均由本实验室保存。 猪死亡的一个重要因素，且死亡率呈显著上升趋 1．2工具酶和主要试剂限制性内切酶BamHl与 势。目前，已有关于副猪嗜血杆菌毒力因子的报 Hind Marker、 道，但对编码神经氨酸苷酶基因的了解还很少，对 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、T4连接酶均为 副猪嗜血杆菌外膜蛋白所引起的致病性研究还处于 TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司的产品；细菌 鉴定阶段，利用毒力因子来区分致病菌株和非致病 基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购白天 菌株还存在缺陷。毒力因子是构成细菌毒力的物质 根生化科技(北京)有限公司；质粒测序由上海生工 基础，在其病原菌的致病过程中发挥主要作用，因 生物工程公司完成。 此对毒力因子生物学特性的研究是探索病原菌致病 1．3 引物设计与合成 根据GenBank数据库中的 机理的首要任务。为了进一步明确致病菌株和非致 病性菌株的差异性，Meike等研究发现在HPS致病由生工生物技术有限公司合成一对引物：上游引物： 5’．GGATCCATTGGTAGTA 菌株基因组内有hhdA基因存在于大多数致病菌株 AAGTGCAAGCG．3’；下 中，而非致病菌株中为阴性。因此，笔者对临床发 III 病猪中所分离的HPS菌株进行hhdA基因的克隆和3’，上下游引物的5’端分别引入BamHI和Hind 重组表达，将为进一步制备hhdA单克隆抗体提供两个酶切位点(下划线处)，预计扩增目的片段大小 免疫原并为研究hhdA分子生物学功能提供重组蛋为1809bp。 白奠定基础。 1 材料和方法 10xbuffur2．5pLL，dNTPs(2．5mmol几)l斗L，上、下 游引物(25¨,mol／L)各0．5斗L，模板DNA2．5汕，Taq 1．1 载体和菌株载体pMDl8-T购自大连宝生物 一229— 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会论文集 条件：首先94℃预变性5min；94。C变性45S， T-hhdA重组质粒经BamHI和Hind111双酶切后，分 58℃退火45S，72℃延伸2min，此阶段共35个循别切出了1809 bp的目的片段和2692bp载体片段 环；最后72℃延伸10min。扩增后，取5PCR