双层微流控芯片的构建与在肺腺癌耐药性分析中的应用.pdfVIP

中华医学会呼吸病学年会-2011(第十二次伞国呼吸病学学术会议)论文汇编 壁报交流 组)，处理16周后换用不含香烟烟雾提取物的普通培养基继续培养8周以模拟肺癌后戒烟患者 (Ex-smoking组)，同时使用一直用普通培养基培养的A549细胞以模拟不吸烟的肺癌患者 (Non-smoking组)作为对照组。提取上述三组细胞的总蛋白，采用蛋白质双向电泳技术和质谱技 术分离鉴定差异蛋白质，应用划痕实验及Transwell实验检测Current 及其对照组Non-smoking组细胞的转移侵袭能力的变化；应用Westernblot及RT-PCR验证差异蛋 白的表达；为探讨这些差异表达蛋白质的临床病理学意义，采用免疫组化染色检测部分差异蛋白质 在存档石蜡包埋肺癌组织(鳞癌70例，腺癌42例)中的表达，统计学分析差异蛋白质表达水平与I临 床病理特征和患者预后的关系。 组细胞的总蛋白质，应用双向凝胶电泳技术建立了重复性和分辨率均较好的的双向凝胶电泳图谱。 PDQuest软件对三株细胞蛋白质的双向电泳图谱进行了比较，发现有19种差异蛋白的表达在去除CSE 比较蛋白质组学研究结果，Western 达水平仍然明显下降，其结果与比较蛋白质组学研究的结果一致。进一步通过划痕实验及Transwell 增高，且经过脱毒处理8周的Ex-smoking组仍然高于对照组，这说明决定侵袭转移能力增高的差异 蛋白在脱毒处理后应该没有回复到对照组的水平。最后，我们通过免疫组化的实验发现患者吸烟严 结转移状况呈正相关，14-3-30表达与区域淋巴结转移状况呈负相关，nm23-H1表达与区域淋巴结 降。 结论本研究采用蛋白质组学技术在体外筛选到41个可能与吸烟导致肺癌进展的差异表达的蛋白质， 预后相关，有望成为预测非小细胞肺癌转移和预后的分子标志物。本文研究结果为研究吸烟导致肺 癌进展的分子机制方面奠定了一定的基础，并在预测非小细胞肺癌吸烟患者人预后及转移方面具有 一定的临床价值。 双层微流控芯片的构建及在肺腺癌耐药性分析中的应用 孟强‘¨，贾莹莹Ⅲ，李恩成…，张倩倩…，王琪乜1 l大连医科大学116027 2大连医科大学附属第二医院呼吸内科 目的高度集成化和微型化是微流控芯片系统的两个主要优势，目前被公认为系统生物学研究的主要 技术平台之一。随着高通量、大样本实验的推广，在“垂直方向”集成多种操作程序的多层芯片成 为研究的必然趋势。肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，然而多数肺癌患者发现后多为晚期，已 中华医学会呼吸病学年会-201l(第十二次全国呼吸病学学术会议)论文汇编 擘报交流 失去手术机会，所以化疗是治疗的重要手段之一，但由于肺癌细胞对多种化疗药物产生耐药性常常 导致化疗失败。多药耐药相关蛋白(MRPl)是ATP结合盒式蛋白超家族的一员，能够通过结合并水 解ATP逆浓度梯度转运相关底物。在本实验中，我们设计一种双层微流控芯片，目的在于在微流控 芯片系统的培养池内培养人肺腺癌细胞系(SPCA-I)，并进行耐药分析，进一步研究MRPl在肺癌耐 药中所起的作用。此微流控装置通过微注射器提供持续培养基目的在于模拟体内细胞生长微环境。 此芯片采用双层设计，能够实现实验组和对照组细胞在芯片上共培养，并在两个实验组之间进行平 行实验操作的目的。 方法本实验使用微流控芯片系统进行肺癌耐药性分析，此系统装置包括1个两层芯片和3个MS26 型微注射器。通过上层芯片进样孔，将浓度为5×106／ml的SPCA一1细胞注入下层芯片培养池内，并 通过微注射器为细胞培养持续提供新鲜培养基。将芯片放入培养箱内培养3天后，借助微注射器将 M)通过下层芯片通道作用于实验组细胞12小时。用免疫荧光的方法检验两组 抑制剂M[1(-571(30p 细胞MRPI表达量。此外，MK一571预处理后，将阿霉素(DOXM)或罗丹明一123(Rh一123g／m1) lOp 59 作用于两组细胞1．5小时。为了验证MK-571能否抑制MRPl的功能，我们用免疫荧光的方法检测两 组细胞内两种药物的胞内浓度。同时，通过上层芯片进样孔，将化疗药物足叶乙甙(VP一16)注