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致穿梭质粒在突变检测中的应用 郝利华 肖希龙 (中国农业大学动物医学院北京100094) 细胞生物学和分子生物学理论和技术的应用使得毒理学研究领域发生巨大的进展，目前有关环境诱 vector 变机理的研究已逐渐从细胞水平向分子水平深入．穿梭质粒(shuttle 从此，为研究化学物质诱发突变和癌变开拓了新的领域，被广泛应用于物理因子和化学物质致突变研究 和突变谱的分析。 1穿梭质粒致突交检测系统及其组成 穿梭质粒是一类既可在哺乳动物细胞中复制又可在细菌中复制的复合型质粒，将穿梭质粒和体外哺 乳动物细胞组成穿梭质粒脯乳动物细胞致突变分析系统． 建立穿梭质粒脯乳动物细胞致突变检测系统必须满足以下几方面的条件：①必须有在哺乳动物细胞 中启动复制和复制的序列：一般常用动物病毒的复制子序列：②有在细菌中复制启动以及维持复制的序 列；③靶基因，一般用遗传背景清楚，功能易于检测的原核或真核基因，靶基因的自发突变频率必须低 于1矿数量级；④真核细胞中选择标记基因：⑤筛选细菌转化子的抗性基因，且转化子数量多等条件． 目前用于致突变检测的穿梭质粒共有4类： SV40病毒类，EB病毒类，BP病毒类和逆转录病毒类。 好。 穿梭质粒带有对突变相当敏感的靶基因，将诱变剂处理的穿梭质粒转染哺乳动物细胞或先转染后经 诱变剂处理，在细胞体内修复系统的作用后，从细胞中提取质粒，转化宿主菌，在一定条件下筛选突变 子。并进一步对靶基因测序以了解突变的位点、类型、序列特异性等信息。由于靶基因的突变是在哺乳 动物细胞内发生，因而能够较真实的反映高等动物的突变机理，同时靶基因的突变又是在细菌中通过显 色反应筛选突变子并进行序列分析，使表型的改变在DNA分子水平上得到证明，且其任何一位置发生 单碱基置换都能从表型检测出来，敏感性极高。 其中最具代表性的是美国学者Seidman构建的pZl89质粒。将质粒转染哺乳动物细胞经诱变剂作用 后提取质粒转化宿主菌，在含X．gaI和IPTG的平板上筛选突变子，正常菌落为兰色，突变后呈白色。 而后作者又进一步对该质粒进行了改建，在靶基因下游加了一个8bp的标识序列，构建了pSPl89质粒。 经诱变后，同时测定靶基因和标识序列．可判断区分独立突变和同胞突变，能更精确的在DNA分子水 平上评价突变的性质和热剖孔。pZl89和pSPl89质粒均为短暂复制型穿梭质粒． 2利用穿梭质粒致突变检测系统研究基因突变的分子机制 2．1菲定标性突交研究 在穿梭质粒致突变检测系统中，质粒进入经染毒后的细菌或哺乳动物细胞而产生的突变称非定标性 突变Io．儿，非定标性突变的出现表明宿主在毒物作用后其内环境处于紊乱状态，并导致了DNA的不稳定 性，这从另一个方面说明了致癌的机制．人类遗传性非息肉病性结肠癌与位于染色体3P和2P的两个错 配修复基因突变而造成的DNA复制有关【1．91，说明遗传不稳定与肿瘤发生密切相关。 tRNA为 余应年ll巩¨一司等对化学诱变荆诱发哺乳动物的非定标性突变作了详细的研究，用含supF tRNA的基因 定标性突变．孙雪敏113】等用Veto细胞在MNNG攻击后不同时间转染质粒pzl黔，在supF 中非定标性突变的发生频率呈明显的时相性．并且细胞在MNNG攻击后用RNA合成抑制剂放线菌素D 阻断基因转录，非定标性突变形成能够被完全抑制．证实MNNG诱发的非定标性突变依存于MNNG处 理后的基因改变，而且实验发现可激活信号转导通路的蛋白质的合成抑制剂放线菌酮不仅抑{钶MNNG 诱发的非定标性突变甚至可促进其发生，这提示非定标性突变的发生有信号转导通路的介入，并且细胞 经MNNG处理后早期就有cAMP浓度的升高，说明可能有cAMP-PKA通路被激活． 细胞非定标性突变发生的时相分析所显示的延迟发生特点和基因表达依存性所显示的后生性机制 提示：是化学诱变剂诱发细胞遗传不稳定的一种表现。已知细胞DNA复制的保真度主要由参与复制的 DNA聚合酶的校读功能和复制后进行错配修复的酶系维系。冯朝辉等11．J用定量RT-PCR方法证明细胞经 以非定标性