不同转导方式及载体形式对TALENs在小鼠胚胎干细胞打靶效率的研究.pdfVIP

第 47卷 第 4期 南 开 大 学 学 报 (自然科学版) Vo1．47 N_o4 2014年 8月 ActaScientiarum Naturalium UniversitatisNankaiensis Aug．2014 文章编号 ：0465—7942(2014)O4—0089—06 不 同转导方式及载体形式对 TALENs 在小鼠胚胎干细胞打靶效率的研究 牟春琳，刘 畅，陈凌懿 (南开大学 生命科学学院，天津 300071) 摘要 ：通过同源重组进行小鼠胚胎干细胞基因敲除是 目前应用最为广泛的基因敲除技术手段，但同源重组 的效率却非常低．TAIEs和 FokI的剪切结构域融合 的TALENs可 以实现高效的基 因敲除．已有报导表 明， TALENs识别位点的DNA序列和长度 ，及 间隔区的长短等条件影响TALENs打靶效率．但外源载体的导入方 式及载体 的形式 (DNA或RNA)是否 以及如何影响TALENs的打靶效率还不 明确 ．用不 同的转导方式将 TAL— ENs导入小鼠胚胎干细胞中，并检测TALENs切割识别位点的效率，实验发现 Lipo{ectamine 2000转染 的 TAIENs比电转化能更高效地切割 目的DNA位点，而 DNA质粒或体外转录 的RNA表达 的TALENs切割 DNA位点的效率相近．数据表明，在应用 TAIENs进行基 因敲除时，有必要选择合适 的转导方式以提高突变效 率 ． 关键词 ：胚胎干细胞 ；TALENs；细胞转染；电转化 中图分类号 ：Q813 文献标识码 ：A 0 引 言 来源于囊胚 (blastocyst)时期 内细胞团细胞 (innercellmass，ICM)的小 鼠胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ES细胞)具有多潜能性 (pluripotency)，即能分化为成体动物中所有细胞类型的发育潜能n]． 通过基 因工程改造可以建立特定基因突变的小 鼠ES细胞系 ，然后利用 ES细胞的多潜能性 ，进一步通过 ES细胞的囊胚注射得到具有基 因突变 的嵌合体小 鼠，并通过生殖系转移将突变的基因遗传给后代 ；或 者通过四倍体囊胚互补实验 (tetraploidcomplementationexperiment)，直接获得具有基因突变的小 鼠 ]． ES细胞 的基 因敲除(knockout)主要通过 同源重组实现[5]．但是 ，同源重组的效率却非常低 ，约为 1O J， 筛选难度大，而且前期构建基 因敲除载体 的操作复杂．因此 ，急需一种打靶高效且载体简单 的基因突变手 段．而 TALENs的出现解决了这些 问题． 转 录激活子样效应 因子 (transcriptionactivator—likeeffectors，TALEs)是在植物病原体黄单胞菌 (Xanthomonas)中发现 的效应因子蛋白(effeetorproteins)，这种蛋白通过 Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system)进入植物细胞质中．TALEs家族成员是黄单胞菌主要的致病性因子 ，其行为与转录因子相似 ，进 入细胞核后直接结合 DNA，从而调控特定 的基 因表达 ，最终导致植物发育进程的改变_．7j． TALE结合 DNA主要由中部的结构域介导 ，其包含 3O多个高度保守且串联重复的氨基酸序列单元 (amino—acid～sequencemotif)．这些氨基酸序列单元包含 33～35个氨基酸，除了第 12和 13位氨基酸可变 外 ，其他氨基酸序列高度保守．这 2个可变氨基酸被称为重复可变双残基 (repeatvariabledi—residues， RVD)lg ．不同的RVD组合改变可以识别不同的DNA碱基 ，例如 ：HD(组氨酸和天冬氨酸)特异 的识别 碱基 C，NI(天冬酰胺和异亮氨酸)特异的识别碱基 ACT]． 收稿 日期 ：2013-10—20 基金项 目：国家 自然科学基金 ；国家重点基础研究发展计划 (973计划)(2O10cB8336O3) 作者简介：牟春琳(1984一)，男，甘肃合作人，博士研究生． 通讯作者