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单色荧光标记表达谱芯片 实验流程 准备One-Color Spike Mix【根据上样量选择稀释步骤】 将One-Color Spike Mix stock solution在vortex上混匀，37度处理5分钟，在vortex上混匀，然后瞬时离心。 第一次稀释：在第一个管子上标注第一次稀释spike-in，在vortex上混匀spike mix，37度循环水浴中加热5分钟，vortex再次混匀，瞬时离心。在管子中加入2 ul的spike mix。再加入38 ul Dilution Buffer，vortex混匀，瞬时离心。 第二次稀释：在第二个管子上标注第二次稀释spike-in，加入第一次稀释液 2 ul，再加入48 ul Dilution Buffer，vortex混匀，瞬时离心。 第三次稀释：在第三个管子上标注第三次稀释spike-in，加入第二次稀释液 2 ul，再加入38 ul Dilution Buffer，vortex混匀，瞬时离心。 第四次稀释：在第四个管子上标注第四次稀释spike-in，加入第三次稀释液 10 ul，再加入30 ul Dilution Buffer，vortex混匀，瞬时离心。 保存：Store the Agilent RNA Spike- In Kit, One- Color at –70°C to –80°C in a non- defrosting freezer for up to 1 year from the date of receipt. The first dilution of the Agilent One- Color Spike Mix positive controls can be stored up to 2 months in a non- defrosting freezer at - 70°C to - 80°C and freeze/thawed up to eight times. 探针标记 将25-200 ng 总RNA加入1.5 ml离心管中终体积1.5 ul。【RNA保存要浓度大于100ng/ul，使用时再稀释】 每个管里加入2 ul稀释后的spike mix，终体积3.5 ul。 按照下表配制 每个管中加入1.8 ul T7 Promoter Primer Mix，终体积5.3 ul。 65度水浴中10分钟，使引物和RNA变性。 冰上放置5分钟。 将5X first strand buffer于80度预热3-4分钟。Vortex混匀，然后瞬时离心。室温放置待用。 按照上表配制cDNA Master Mix。 瞬时离心每个反应管，每管中加入4.7 ul cDNA Master Mix，用枪混匀，终体积10 ul。 将反应管在40度水浴中，放置2小时。 然后转入70度水浴中，放置15分钟。 然后冰上放置5分钟，瞬时离心。 保存：如果想在此暂停实验，可以放置于-80度保存。 按照下表配制Transcription Master Mix 每反应管加入6 ul Transcription Master Mix，用枪混匀，终体积16 ul。 然后在40度水浴中处理2小时。 保存：如果想在此暂停实验，可以放置于-80度保存。 纯化探针【0.5h】 加84 ul nuclease-free water到cRNA【标记后的探针】中，总体积100 ul。 加入350 ul buffer RLT 然后用枪混匀。 加入250 ul （96%-100%）乙醇，用枪混匀【此处不离心】。 将总共700 ul体系转入RNeasy mini column中，13000 rpm，4度离心30秒，弃滤过液。 将RNeasy mini column转入新的收集管中，加500 ul RPE，13000 rpm，4度离心30秒，弃滤过液。 再加500 ul RPE到RNeasy mini column，13000 rpm，4度离心60秒，弃滤过液和收集管。 将RNeasy mini column转入新的收集管中，加入30 ul RNase-free water，等60秒后，13000 rpm，4度离心30秒。冰上放置滤过液。 测定标记效率 芯片杂交 按如下比例配杂交体系 60度处理30min，使cRNA片段化，然后迅速冰上处理1 min。【不要再这一步停留超过30min。冰上放置或加入2×hybridization buffer均可以终止fragmentation过程】 按下表加入合适体积的2×GEx Hybridization Buffer HI-RPM【目的：终止片段化过程】 用枪混匀【不要用vortex】，一定避免产生气泡。 13000 rpm 室温离心1 min。 冰上放置，