糖心康对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡促进和抑制因子基因表达的调控作用.pdfVIP

糖心康对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡促进与抑制因子基因表达的调控作用 姜德友1柳成刚1刘晓晶1单文1李雪丽1 刘征1陈永坤1姚丽‘李秀源1黄永麟2 150001) (1、黑龙江中医药大学 150040，2、哈尔滨医科大学 细胞凋亡是近年分子生物学领域研究的热点之一，动物实验证实细胞凋亡在糖尿病心肌损伤病理演变过程 中占重要地位，甚至在糖尿病心肌纤维化方面扮演重要角色。因此干预心肌细胞凋亡发生、调控与心肌细胞相 关因子基因表达在糖尿病心肌损伤防治研究中具有重要意义。 材料与方法 一、主要试剂和药品 Fas试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，原位末端标记检测试剂盒购自德国ROCHE一酬公司。有关芯片试剂 及仪器设备．均为上海博星基因芯片公司备制。 二、动物造模及分组 随机分为模型组和治疗组。各组均喂以高热量饲料。 三、给药方法 治疗组以中药糖心康灌胃，空白组及模型组以生理盐水灌胃。 四、标本采集 快速用一18012、12h处理过的手术剪刀摘取心脏，立即用预冷的生理盐水冲洗，冲洗后在冰上操作，沿心 室长轴切取心肌，部分置于2．5％戊二醛及4％多聚甲醛固定，供光、电镜观察使用，部分置于液氮中冻存，以各 提取RNA使用。 五、细胞凋亡检测 (1)TUNEL法检测心肌细胞凋亡。具体步骤按试剂盒使用说明操作。阳性制定标准：以细胞核被染成棕褐色为 阳性结果。(2)电镜超微形态学检测心肌凋亡，其特征是：细胞核染色质密度高并边集，核固缩畸变，核膜内陷， 部分胞浆弥漫性染成棕褐色为强阳性表达(+++)：部分胞浆染成淡棕黄色，部分胞浆不着色为弱阳性表达(+)，介 于两者之间的为阳性表达(++)。 六、基因芯片检测 自然对数值InRi=In ze系 Pro 照组)：图像处理软件：GenePix3．O：对于某一点的两种叠加荧光信号，如果cy3信号较强，该点多显绿色 (下调趋势)：如果cy5信号较强，该点多显红色(上调趋势)：如果强度相似，即显黄色。(5)不同心肌组织样 度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号：数据点若为红色，则代表Y值与x值的比值在 属于差异表达)。 结 果 169 一、超微结构变化：模型组细胞核异形变，核周边有切迹，固缩，染色质边集：而正常组及糖心康组未见细 胞凋亡样改变。 ：、心肌细胞凋亡的比较：模型组细胞凋亡较正常组发生率明显增加，两组比较差异非常显著(P0．01)， 而糖心康组心肌凋亡率则下降，说明糖心康有抑制心肌细胞凋亡作用。见表l。 表l各组细胞凋亡的比较(x±S) 注：与正常组比较}PO．01与模型组比较△P0．叭 三、心肌Fas基因表达水平变化：模型组大鼠心肌损伤，可显著引发Fas基因蛋白表达增强，与正常组比较 制Fas基因表达作用。见表2。 表2 各组心肌内FAS基因表达水平比较(i±s) 注：与正常组比较}PO．01与模型组比较△P0．01 较差异显著(P0．01)。见表3。 表3 各组心肌内BCL-2基因表达水平比较(一X±S) 注：与正常组比较}P0．01 与模型组比较△P0．01 异表达数据392项。双点均一异常表达基因124个。表达稳定的管家基因87个。其中与细胞凋亡有关的促进与 抑制因子基因主要有2个，即AF041376、M75720。 讨 论 近年来，有关细胞凋亡与糖尿病慢性并发症关系的报道日臻增多，Drtiz等发现，无论是体外实验．还是 体内实验，均存在高糖状态下的凋亡增加、bcl一2基因及其相关的bc卜x基因的表达出现降调节，而拮抗bci一2、 具有致凋亡作用的baxmRNA水平则显著增高。他们还发现，应用D一甘露醇造成