样品制备与双向电泳技术.ppt

Mo7e白血病细胞在阻断泛素通路过程中蛋白质组学比较研究（三） 阻断剂药物处理后蛋白斑点动态变化 0 h 2 h 6 h 12 h 24 h U T 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析 （ MALDI-TOF-MS，Bruker Reflex III型） 生物质谱 对蛋白点T 进行分析 MALDI-TOF-MS肽质量指纹谱图 及其检索结果 对eIF-5A蛋白进一步分析是否发生 -CH2-CHOH-(CH2)2-NH2 特殊基团的翻译后修饰 第49位赖氨酸残基是否修饰形成Hypusine决定eIF-5A活性 Lysine 无活性的eIF-5A 有活性的eIF-5A 活 性 第49位Lys发生下列翻译后修饰 -CH2-CHOH-(CH2)2-NH2 检索结果：eIF-5A Hypusine -CH2-CHOH-(CH2)2-NH2修饰 阻断泛素通路的蛋白质组分析 Oncogene 2003, 22:4819-4830 蛋白质组研究的复杂性 tremendous protein chemical diversity great protein dynamic changes large protein concentration range ! 人猿分手，屈指仅数百万年！ Same genome Different proteome 人类基因：30000 , 10-100蛋白质/基因 自然界中存在的蛋白质种类1012 已知氨基酸序列的蛋白质数60万 “蛋白质组计划比基因组计划困难１００倍，因为基因图只有一张，而蛋白质图每个器官都有一张。由于鲜有经验可以借鉴，我们只有‘自力更生’，使一个计划中得出的数据和经验立刻和其他计划共享” 国际人类蛋白质组组织启动计划主席萨姆·哈纳什 问 题 蛋白质组学关键技术 双向电泳的原理与特点 蛋白质的定量方法 谢谢 * 与国际知名蛋白质组研究单位进行了技术交流与合作探讨 * This slide shows the classical proteomic strategies, they have advantages and limitations * * * * * * * * * * * 一直是凋亡研究中最重要的一个课题，上述发现表明他们之间存在有直接的关系，即Bcl-2蛋白是Caspase-3的直接底物。 * * * 二（多）维色谱质谱技术（2DLC－MS/MS，MDLC-MS/MS） 高通量； 可全自动化； 灵敏度较高； 基本无蛋白质偏好性； 适合功能蛋白质组学； 做比较蛋白质组学较难； 难以获得等电点； 仪器成本较高； 存在假阳性； 蛋白质组学基本研究策略 蛋白组学分析策略 基于质谱的蛋白质标记定量技术（Labeling quantitation） 体内标记（in vivo labeling）定量技术 （Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture, SILAC ） 体外标记（in vitro labeling）定量技术  （isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ） iTRAQ 体外标记定量原理 iTRAQ 体外标记定量原理 SILAC 体内标记定量原理 e.g.,iTRAQ ITRAQ SILAC 可标记样品 所有蛋白样品（多肽） 活的细胞或生物体 标记效率 化学反应 高，可随时检测 试剂价格 昂贵 昂贵 根据研究内容有所不同 应用范围：细胞组织和血清等各种样品的比较蛋白质组研究。 优点：样品用量少；速度快。 缺点：低丰度蛋白不易检测，较难分析蛋白的剪切和修饰。 Lable-free定量蛋白质组技术的特点 蛋白质是生命功能的主要执行者，许多蛋白质功能的发挥是通过蛋白质相互作用实现的。研究蛋白质相互作用是研究蛋白质功能及作用机制的重要内容。 蛋白质相互作用分析 蛋白质复合体及翻译后修饰分析策略 Con Gan Con Gan 250 150 100 75 50 37 25 20 15 * * * * * * * * * * * * * 3×Flag peptide elution beads PSMC2: 26S protease regulatory subunit 7; Proteasome 26S subunit ATPase 2. Function: In case of HIV-1 infection, p