肝素结合性表皮生长因子转基因小鼠的建立与功能研究.pdfVIP

肝素结合性表皮生长因子转基因小鼠的建立和功能研究 彭健豪 邸 冉董伟张连峰。 (中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所，北京100021) 扩张性心肌病是最常见的心脏疾病之一，是导致心脏衰竭的第三大常见原因。选择性 ErbB2敲除的小鼠为研究ErbB2受体特异的抑制剂赫赛汀所引起的扩张性心肌病和心力衰竭 提供了动物模型。现已证实，ErbBs信号系统在胚胎期心脏的发育过程中和维持成体心脏的 growth 功能方面都具有重要的作用。肝素结合性表皮生长因子(heparin—bindingepidermal factor—like growth 介导的信号通路在维持心脏的正常功能和心脏瓣膜的发育中起非常重要的作用，为了研究 治疗心疾病的可能性，我们建立了HB—EGF转基因动物模型并对其功能进行了研究。 1材料与方法 1．1 实验材料 a—MHC Medical Clone26来自BaylorCollege，Shinider —Strand forRT—PCR、Platinum⑥PfxDNA Synthesis System Gel Kit quickExtraction blotluminal 博远志公司完成。HB—EGF(M一18)多克隆抗体、Western CRUZ公司产品。Prestainedmarker，broad protein STAINING 购自中杉金桥。BrdU 显微注射仪为Nikon TE2000一U，倒置显微镜为Olympus产品。 1．2实验方法 Strand for Synthesis RT—PCR试剂盒反转录获得邶一EGFcDNA，通过高保真酶进行 System PCR扩增获得带有蹦I酶切位点的HB—EGF Vector连 cDNA的目的条带，将其与pMDl8一T 7 5 接送去测序。引物序列：pHB—EGF—F R5’atgtcgacAAGTAGCCTCTGAAGGTICCTATAG。 Clone26，含有在小鼠心 1．2．2转基因注射片段的制备：用于转基因的载体是a—MHC 脏组织中特定表达的启动子和增强子。将Clone26用sall酶切，去磷酸化，胶回收载体。 用RocheT4DNA Clone26和经测序正确的目的片段连接，构建成a— ligase将载体a—MHC MHC—HB—EGF表达载体。然后经Not G50柱纯化 I酶切将表达载体线性化，Sephedex ·通讯作者，Tel E—mail：Lianfeng—Zhan93@yahoo．colll．∞ ·120· DNA，通过凝胶电泳进行定量后用于显微注射。 1．2．3转基因操作：用孕马血清和人促绒毛膜性腺激素对3～4周龄的C57BL6小鼠 进行超排后，从输卵管的壶腹部将受精卵取出，向受精卵雄性原核中注入DNA溶液，在二 氧化碳孵箱(37℃)中培养一夜，将发育成两细胞的卵挑选出来，移植到ICR假孕小鼠的输 卵管中。 1．2．4转基因阳性鼠的PCR法鉴定：为确认小鼠中是否有转入的基因，采用PCR扩增 —EGF