VHb在产L-苯丙氨酸工程菌中的表达和功能研究.pdfVIP

VHb在产L-苯丙氨酸工程菌中的 表达与功能研究3 黄钦耿2 吴伟斌2 翁雪清2 施巧琴1，2 吴松刚1，2 1工业微生物发酵技术国家工程研究中心{福建师范大学}福州 2福建麦丹生物集团有限公司福州研究中心 福州 [摘要]采用人工设计合成优化的vgb基因及其天然的低氧启动子序列，并进行融合T7 终止子克隆至L-Phe的高表达质粒中，转化大肠杆菌，构建高产抗贫氧高密度发酵L-Phe 的基因工程菌。低氧诱导vgb基因的表达，工程菌高密度发酵较对照工程菌结果显示：细 胞浓度(0D610)提高20％，L-苯丙氨酸产量提高14％. [关键词]L-苯丙氨酸;透明颤菌血红蛋白;低氧诱导;发酵 能：表达外源透明颤菌血红蛋白(VHb)，增强细胞对氧的摄取能力，从而提高 细胞对氧的宽容度，保证细胞在贫氧条件下的正常生长。透明颤菌 长于泥塘腐叶等贫氧环境中，是一种专性好氧菌，其细胞能够在低氧环境中诱 导合成一种可溶性的血红素蛋白，结合环境之中的氧气，起到富积氧气以供细 胞利用的作用。 本研究在前期的研究基础上通过密码子优化后，人工合成透明颤菌血红蛋 白基因(vgb)及天然低氧调控序列，并且融合T7终止子，插入原始苯丙氨酸 工程质粒，构建抗贫氧高密度发酵L-Phe的工程菌，研究VHb表达对细胞生长 及苯丙氨酸产率的影响。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1菌株和质粒 ooliK1 苯丙氨酸基因工程宿主菌E$che厂ich／a2为本研究中心自行改造构 coli 建，载体克隆受体菌E$cherich／aJMl09购自TAKARA；苯丙氨酸基因工程 pUCvgb载体自行设计．委托上海生工合成。 1．1．2主要工具酶和试剂 限制性内切酶、DNA聚合酶、T．连接酶、去磷酸化酶(CI^P)等均购自TAKARA； PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒等均购自上海生工．其它药品均为国产分析 纯。 1．1．3培养基 LB培养基：配方参阅分子克隆实验指南(第三版)． 工程菌种子及发酵培养基：为企业内部资料(略)． 1．2方法 1．2．1pETvgb表达载体的构建 割胶回收，30C水浴酶切反应5h后，分别进行电泳割胶回收所需的DNA片段：vgb 基因和pET28a的线性片段．然后将目的片段用T,DNA连接酶连接，构建表达载体 42 pETvgb· 1．2．2 vgb基因表达元件的扩增及PCR测序验证 利用分子生物学软件，分析并设计融合vgb基因和低氧启动子以及T7终止 子序列的PCR引物，引物设计如下： GAT TGGGTCGCG CCTGTGG-3’ PvgbT—f：5’咔GTcAcq GTTCCTCCTTTC_3’ CCGGATMA PvgbT-r。5’-J(GGTCACg 其中方框中的序列为引入的单切位点序列． 以pETvgb表达载体为模板进行融合vgb表达元件的PCR扩增。电泳回收目的 coli 片段并与pNDl8T载体进行T-A克隆，转化感受态EJNl09细胞，筛选阳性克 隆子并送交含有vgb基因表达元件的阳性克隆子于上海生工进行测序。 1．2．3抗贫氧苯丙氨酸工程质粒的构建 分别对原始工程pMDphe及含有vgb表达元件的载体pMDl8vgb进行船印I 的单酶切消化和去磷酸化后进行回收，再利用T．DNA连接酶进行连接构建新的 抗贫氧发酵的工程质粒pMDphevgb． 1．2．4苯丙氨酸工程菌的发酵培养 采用30L全自动发酵罐对工程菌进行二级发酵，通过搅拌控制发酵罐溶氧 (∞)水平至D0=5-15％，36．5℃进行补料分批发酵，发酵周期约为46h． 1．2．5发酵液苯丙氨酸含量的测定 采用三波段法进行L_苯丙氨酸含量的测定。 1．2．6透明颤菌血红蛋白的SDS检测 分别取发酵16h与32h的发