几种药品对聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的影响.pdfVIP

维普资讯 2005年第25卷第2期 水 利 渔 业 (总第 138期)·13 · 几种药品对聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的影响 王亚军，吴立山，厉盛华，刘必谦 (宁波大学海洋生物工程重点实验室 315211) 摘要：探讨了几种药品在聚丙烯酰氨凝胶电泳 (P )银染过程中的作用原理，利用单药品实验对各个 药品在银染过程所起的作用进行分析，获得了不同药品所对应的实验现象，有效地解决 P银染中药品的 质量 问题。 关键词：聚丙烯酰氨凝胶电泳；银染；药品质量 中图分类号：$917 文献标识码：A 文章编号：1003一l278(2005)02—0013—02 乩 P(Amplifiedfragmentlengthpolimorphism)技术 少，胶板易粘胶而导致胶破裂(见图lb)；如2～3rain分钟 是1992年发现的一种新的DNA指纹技术…1，它兼具 就开始凝固，则过硫酸铵过量，一方面不容易进行下面操 RFLP(Restrictionfigmentlnegthpolymorphism，限制性片 作，如梳子的插入、气泡的清除，另一方面过多的过硫酸 段长度多态性)的复杂程序和RAPD(Randomlyamp~fied 铵影响电泳，DNA带容易发虚、扭曲(见图1c)。为了减少 polymorphicDNA,随机扩增多态性DNA)的不稳定性，具 过硫酸铵对电泳的影响，一般需先进行30min的预电泳。 有不需预知DI 序列、共显性、检测信息量大、处理样品 多、灵敏度高、易操作等优点[2--6】，是构建动植物高密度 2 冰醋酸 的遗传图谱、筛选分子标记及研究遗传多样性的理想分 又称乙酸，具有刺激性气味的无色液体。在银染过 子标记[。 程中37％的冰醋酸主要起到两方面的作用。①固定。将 聚丙烯酰氨凝胶电泳 (PAGE)银染是 AFLP技术的 电泳的DNA片段固定在测序胶中，除去电泳缓冲液和凝 关键。它能很好地分离鉴别核酸小片段，与琼脂糖凝胶 胶中的尿素。并防止小的延伸产物的扩散。固定后染料 电泳相比，操作复杂，价格高，但其分辨率高。能分辨相差 指示剂(溴酚蓝和二甲苯青 FF)两色带完全褪色。②停 几个碱基的核酸小片段，结果可永久保存。从该胶中回收 显。由于在酸性溶液中感光材料会中止显影过程，故冰 的DNA纯度极高，可适用于分子生物学中较高要求的实 醋酸常单独配制成停显液，或加入定影液中延长定影液 验等 8【，引。但是，在实验过程中，常会出现一些问题，如： 的使用寿命。方卫国等 1【5]认为固定液、停显色液可反复 胶破裂、背景太深、无 DNA带或带纹不清晰等。乐晓 使用达10次以上，但作者在第2次使用时发现，固定液对 萍[o。、朱名安[川、潘尚领[12l、刘建斌[13】等对PAGE银染 染料指示剂条带的褪色效果明显下降。最后结果中的 进行了一系列的研究，取得了不少进展，但主要集中在操 DNA带着色浅，而背景颜色加深 (见图 1d)，分析可能是 作时间、温度、光强等方面，而对于种类繁多的药品则没 冰醋酸量不够，其固定、停显能力减弱所致。 有专门的研究。作者通过对几种药品进行单独实验来研 究它们在PAGE银染中的作用，为进一步广泛利用AFLP 3 硝酸银 技术提供参考。 无色透明片状结晶颗粒，其溶液中的银离子可与核 1 过硫酸铵 苷酸中带负电的磷酸基团共价结合，并在碱性环境条件 下，由甲醛还原成黑褐色的金属银沉积于胶中而显示 丙烯酰胺是一单体，在催化剂NN，N·。N，一四甲基 DNA带型L1引。在染色时，应待硝酸银完全溶解并混匀后 乙二胺(TEMED)的存在下，由过硫酸铵提供 自由基，引 才将胶放人，否则银颗粒会潜入胶中，使背景杂乱。硝酸 发丙烯酰胺单体发生链式反应，聚合成长链，加入交联剂