葱蝇PDK1基因的克隆和生物信息学分析.pdfVIP

葱蝇PDKl基因的克隆和生物信息学分析 申力郝友进罗钱春陈斌 (重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所重庆市动物生物学重点实验室 重庆401331) proteinkinaseI，PDKI)是磷 摘要：3．磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3．phosphoinositide．dependent 脂酰肌醇3．激酶(phosphatidy】inosit01．3 的激酶。该通路在人、果蝇、线虫中是一条保守的通路，通过激活下游的因子从而对代谢、 细胞分化、寿命等产生重要调节作用。本研究基于葱蝇(Delia 021嘶ua)转录组测序数据通过 生物信息学分析从其中鉴定出PDKl4个Unigene序列，基于这4个序列设计出了特异性引物 bp，开 放阅读框长2730 bp，编码909个氨基酸。采用生物信息学的方法，推测该基因编码的蛋白质 ％)。为进一步研究葱蝇P13K／Akt信号通路PDKl基因的特性及功能奠定了基础。 关键词：葱蝇；PDKl；克隆；生物信息学分析 中图分类号：Q966 P13K／Akt信号通路具有很高的保守性，目前在人类、小鼠、果蝇、线虫、和酵母中都有发 现【l】。胰岛素、胰岛素样生长因子．I(IGF．1)与细胞膜受体结合，导致了与受体相联系的P13K的 激活，P13K磷酸化内膜脂成分4，5-二磷酸磷脂酰肌醇[phosphatid2yrlinositol homology 活其下游的因子，如糖原合成酶3、叉头转录因子和S6蛋白激酶等，从而对糖、脂肪和蛋白质 的代谢，细胞分化、增殖和凋亡，生殖能力和寿命等产生调节作用【3】。所以，PDKl可以通过 A1ct发挥功能【4】。 在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)和黑腹果蝇(Drosophilamelanogaaster)中，抑制 保守的P13K／Akt信号通路，下游因子FoxO蛋白无法磷酸化而转移到细胞核中，进而激活和 滞育特点相关下游基因，包括脂肪积累、抗氧化和寿命延长等15，6，7】。最近在研究尖音库蚊(Culex pipiens)滞育调控分子机理中也被证实【8】。 滞育(diapause)是昆虫在发育的特定时期发育停滞的现象，是对不利环境的一种适应性。 其特征是新陈代谢降低，脂肪含量增高、抗性增强等【9】。葱蝇(Deliaanffgua)是双翅目、花 蝇科、地种蝇属昆虫，同时具有冬滞育和夏滞育，且出现在蛹期头外翻之后的同一发育点[10】。 研究发现P13K_／Akt信号通路通过对FoxO负调控在昆虫滞育调控起了重要的作用，而葱蝇 47 PDKl作为P13IGAkt信号通路的关键性酶，目前与滞育的关系还不清楚。 本研究基于葱蝇转录组，克隆了DaPDKl的全长cDNA序列，通过生物信息学分析，分 构建了系统发育关系。本研究为揭示DaPDKl的特性及功能奠定了基础，希望对进一步阐明 保守P13FdAkt信号通路在调控葱蝇滞育机理提供帮助。 1材料和方法 1．1葱蝇饲养与取样 葱蝇为重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所饲养的实验室种群。成虫饲养在温度 L：8 23+1．0℃，光周期为16h光照：8 D)，相对湿度50-70％条件下。葱蝇非滞育 h黑暗(16 幼虫和蛹饲养在温度18：if)．2C，16L：8D，相对湿度50--70％的条件下【1l】。 收集非滞育一龄、二龄、三龄末期幼虫用于DaPDKl克隆的总RNA的提取。 1．2主要试剂 菌株：大肠杆菌DH5a为本实验室保存。 酶和试剂：RNA提取试剂Trizol