梅花鹿S100A4基因的克隆和原核表达.pdfVIP

梅花鹿S100A4基因的克隆及原核表达 张英 李莉 郝林琳 刘松财 于浩 吉林大学畜牧兽医学院 吉林长春130062 摘要：为研究梅花鹿S100A4蛋白在鹿茸发生中的作用机制，需要大量制备S100A4蛋白纯品。 本研究从梅花鹿锯茸血细胞中提取总RNA并进行反转录，用设计的引物扩增S100A4基因， 将PCR产物克隆到pMD18-T载体并测序。S100A4基因序列同源性分析结果显示，梅花鹿 S100A4基因与牛S100A4基因同源性最高(98.4％)。而后将扩增的梅花鹿S100A4基因片段和 原核表达质粒pET-28a(+)分别用EcoRI和HinfⅢ进行双酶切并连接，再将重组质粒转入BL21 (DE3)表达菌株进行诱导表达。酶切鉴定结果表明，成功构建了表达梅花鹿S100A4基因 的重组质粒pET28a-S100A4，SDS电泳结果表明S100A4蛋白获得成功表达。本研究成 功地实现了梅花鹿S100A4基因的体外表达，为下一步研究S100A4蛋白在鹿茸生长过程中的 作用机制奠定了基础。 关键词：梅花鹿；S100A4基因；克隆；表达 第十二届学术研讨会 dT引物 采集梅花鹿锯茸血，用总RNA提取试剂盒提取梅花鹿鹿茸血总RNA，用oligo 将RNA反转录成cDNA。 1．4引物设计 cDNA，引物序列如下： 上游引物：A鱼丛巫￡A1’G(℃ATACCCC(嬲AG 下游引物：G—AAG—CTIYCACITITFCCGGGGITG 其中在上游引物引入EcoRI酶切位点，下游引物引入例，l砌酶切位点，根据牛S100A4 基因序列长度和所设计的引物位置，推测目的片段大小在320bp左右。 1．5PCR扩增 dNTP PCR反应体系：cDNA49L、10x缓冲液2此、2．5mmol／L2止、上游、下游引物各 0．5皿、TaqDNA聚合酶0．25归、ddH2015．75；皿，混匀后进行PCR扩增。PCR反应条件：9512 预变性5min：9512变性30sec，5512退火30sec，7212延伸30sec，30个循环；72℃延伸 10min。用109／L琼脂糖凝胶电泳检查扩增条带。 1．6PCR产物克隆鉴定 电泳后切胶回收320bp左右的目的片段。回收产物与克隆载体pMDl8-T连接，连接产 物转化感受态大肠杆菌DH5a，通过PCR进行初步鉴定筛选，对阳性克隆质粒进行测序鉴 定。 1．7序列分析 猪、犬、鼠源的S100A4基因进行同源性比较。 1．8表达质粒pET28a．S100A4的构建 I和例hdⅢ双酶切，并以 将克隆质粒pMDl8．S100A4质粒和pET一28a(+)载体分别用EcoR 3：l的比例4℃过夜进行连接构建表达质粒pET28a-S100A4。连接产物转化大肠杆菌BL21 8h，挑取单菌落，接种子含 (DE3)，涂布含Kan(30lag／rid)的LB琼脂平板，置37℃温箱培养l I和HindIII习叹酶切鉴定。 gan(30“g／mD的LB液体培养基扩大培养后提取质粒，用EcoR 1．9重组蛋白诱导表达 100A4的BL21(DE3)菌液按h100的比例加入含Kaa 将酶切鉴定正确的pET28a-S 液进行SDS—PAGE电泳，并经考马斯亮蓝R250染色，脱色后拍照． 2结果 ZlPCR结果 梅花鹿S100A4基因的P(：R扩增产物用109／L琼脂糖凝胶电泳进行检测，可见大小为 第十二届学术研讨会 291 320bp左右的电泳带，与预期大小相符(见图1)。 2 bp