嗜热古细菌Sulfolobus tokodaii脱卤酶在D-乳酸生产中的应用.pdfVIP

Vol_36 高 等 学 校 化 学 学报 No．4 2015年4月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 698～703 doi：10．7503／cjc 嗜热古细菌 Sulfolobustokodaii脱 卤酶 在 D-乳酸生产 中的应用 解桂秋 ，‘潘 东 ，何文龙 ，高 贵 ，高仁钧 (1．吉林大学药学院，长春 130021； 2．吉林大学生命科学学院，分子酶学工程教育部重点实验室，长春 130012) 摘要 将来源于嗜热古菌Sulfolobustokodaii的脱卤酶 (L—HADST)基因克隆到载体pET28b，转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行表达，在蛋白的N末端带有6个组氨酸融合标签，纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示融合 蛋白的分子量约为25000．融合蛋白催化2-氯丙酸(2-CPA)的最适反应温度为70℃，最适 pH值为9．5．以 外消旋2-CPA为底物生产D一乳酸，利用HPLC检测反应液中2-CPA及乳酸的变化，发现L-HAD 只催化 ．2． CPA脱氯反应．对酶催化反应条件进行了优化 ，结果表明，在pH值为9．5，温度为60℃的条件下，当反应 体系中缓冲液浓度为3mol／L，底物浓度为0．5mol／L，酶浓度为3x10U／L时有较高的底物转化率及乳酸生 成量．依据条件优化结果可知，影响反应速度的因素有底物浓度、缓冲液浓度以及酶浓度 ，其中底物浓度变 化对转换率的影响最明显． 关键词 L-2-卤代酸脱卤酶；2-氯丙酸；乳酸 中图分类号 0621．25 文献标志码 A 脱 卤酶是一类对含 卤素有机物具有脱卤素功能的蛋 白，其所作用的物质大多为具有稳定碳一卤键 的卤代有机化合物．由于多种 卤代有机复合物被广泛用于除草剂、杀虫剂、抗生素、药品、塑料制品、 溶剂、制冷剂及合成重要中间体的前体物等的生产，因此 卤代有机物的生产与应用过程会污染环境， 对动植物均有毒害作用 j．同时，具有立体异构选择性的脱卤酶，如 _2一卤代酸脱 卤酶，可对具有手 性的有机卤代物进行光学拆分，并可利用其对生成产物立体异构性的影响合成一些手性物质，如可通 过 一卤代酸脱卤酶降解L一2-氯丙酸(2-CPA)合成D哥L酸．脱卤酶对底物立体异构性的选择以及手性物 质合成方面也备受关注． 来源于嗜热古细菌 (Suflolobustokodaii)的嗜热脱卤酶L-HADST(ST2570)属于 -2一卤代酸脱卤酶 (L．2．HAD)超家族，能选择性地催化 -2卤代烷酸转变为D一2．羟基烷酸，其催化机制如Scheme1所示． 已有文献 对其在原核表达系统中的克隆与表达 进行报道．本文发现该酶具有分子立体选择性并能 义 娑 催化L一2一卤代酸进行脱 卤反应，而且催化反应过程 L一2-Haloalkanoicacid 三一2-Hydroxyalkanoicacid 导致产物的立体特异性转变，使得 ．2卤代烷酸转 变为D-2．羟基烷酸．酶在催化有机反应时其活力经 Scheme1 Hydrolysisreactioncatalyzedby L-2-dehalogenase 常受到有机溶剂的抑制甚至破坏，相对而言，嗜热 酶比常温酶对有机溶剂的耐受力要强，已经有不少嗜热酶被表达及用于催化反应 川．L-HAD 也是来 自古细菌的嗜热酶，同样具有优越的热稳定性和极好的pH耐受性，耐受范围为pH=2一l2．D型乳酸 作为一个重要的手性中间体在农药化工领域得到重视，并已用于芳香丙酸类除草剂的生产．在医药方 面，乳酸与其它材料形成的共聚物纳米粒子或纳米纤维是理想的药物载体 ’I8]．高光学纯度的D型乳 酸与甲醇发生酯化反应形成的D一乳酸 甲酯可