菌落PCR产物直接测序方法的建立及在水稻基因测序中的应用.pdfVIP

维普资讯 中国水稻科学 (ChineseJRiceSci)，2005，19(5)：463~466 httpt}|w w．ricescience．org 463 菌落 PCR产物直接测序方法的建立及在水稻基因测序 中的应用 毛伟华 (浙江大学分析测试中心，浙江杭州310029) EstablishmentofDirectSequencingM ethodwithColonyPCR ProductsandItsApplicationin RiceGeneSequencing MAOWei—hua (CenterofAnalysisandMeasurement，ZhejiangUniversity，Hangzhou310029。China) Abstraet：A methodfordirectsequencingusingcolonyPCR productswasestablished．Undercontrolledconditions，colo— nyPCR could beusedtoscreenand identifypositiveclone，anditsproductscouldbeusedassequencing templatesdirectly． Thesequencingresultwasreliable．ComparedwithconventionalplasmidDNA sequencingmethod。colonyPCR productsse— quencingmethodwasfasterandsimpler．However，whentheproductswereusedtosequencetheDNA with longPolyT and PolyA，thesequencing efficiencywaslow． Keywords：colonyPCR；plasmid；sequencing；methodology；rice 摘 要：建立 了以菌落 PCR产物作 为 DNA测序模板进行快速测序 的技术方法 。研究结果表 明，采用菌落 PCR技术 ， 以载体插人位点两端序列互补的通用引物 (如M13正反向引物)为引物 ，在控制菌落PCR反应条件的情况下 ，不仅可用于筛 选和鉴定阳性克隆 ，而且菌落 PCR产物还可作为 DNA测序模板 ，结果准确可靠 。与常规质粒测序方法 比较 ，该法快速、简 便，但对具有 PolyT、PolyA过多的序列进行测序时 ，该法测序效率较低 。 关键词：菌落PCR；质粒 ；测序 ；实验技术 ；水稻 中图分类号 ：Q94—336；Q943；S-3 文献标识码 ：A 文章编号 ：100卜7216(2005)05—0463—04 转化菌阳性克 隆的筛选鉴定和测序技术 已成为当今分 M13反 向引 物 ：5AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 子生物学领域一项不可缺少 的实验技术手段 。当前在 阳性 3，转化受体菌为 TG1。 克隆的筛选和测序过程 中一般采用抗生素筛选 、蓝 白斑筛 1．2 步骤 选 、质粒抽提 、酶切等一系列工作程序[1]，然后再对 已鉴定的 1．2．1 茵落和茵液培 养 阳性克隆进行接种、质粒抽提、琼脂糖凝胶 电泳检测质粒浓 将水稻基因 PCR产物与载体进行连接 ，连接产物转化 度和纯度 ，最后进行 DNA测序 。整个过程烦琐费时，而且 大肠杆菌 TG1感受态细胞 ，并涂布于含氨苄青霉素的LB培 存在着重复步骤 ，特别在筛选量大时，不仅浪费大量人力财 养基上 ，37℃下培养 12～16h，待菌落长出后 ，用灭菌牙签 力 ，工作效率还受到很大限制。菌落 PCR是 以转化菌单个 挑取 白斑 ，接种到 1mLLB液体培养基 (含抗生素)的 96孔 克隆为模板 ，